【摘 要】
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为了解决Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus genotypeⅡ,GCRV-Ⅱ)含量和滴度测定方法的选择问题,本研究利用荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)、 免疫过氧化物酶单层
【机 构】
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中国水产科学研究院珠江水产研究所, 广东省水产动物免疫技术重点实验室,农业农村部渔药创制重点实验室, 广州510380;天津农学院水产学院, 天津, 300384
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为了解决Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus genotypeⅡ,GCRV-Ⅱ)含量和滴度测定方法的选择问题,本研究利用荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)、 免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase mono-layer assay,IPMA)和间接免疫荧光试验(indirect fluorescent assay,IFA)三种方法来对GCRV-Ⅱ进行检测和含量测定,从特异性、 敏感性、 可靠性和检测结果的相关性来比较这三种方法对于GCRV-Ⅱ定量检测的差异.结果显示:qPCR、IPMA和IFA三种方法检测GCRV-Ⅱ的最低限分别为8.6、86和86拷贝/μL,qPCR的检测灵敏度比IPMA和IFA高一个数量级;特异性分析表明,qPCR、IPMA和IFA三种方法均只能检测出GCRV-Ⅱ型分离株,而其它病毒和未感染病毒的阴性对照细胞均为检测阴性,表明这三种方法均具有较高的特异性;3种方法分别检测60份已知临床样品,qPCR、IPMA和IFA的诊断敏感性和特异性分别为96.7％(29/30)和100％(30/30)、100％(30/30)和93.3％(28/30)及100％(30/30)和100％(30/30);三种方法对于GCRV-Ⅱ的定量检测结果中病毒拷贝数和病毒滴度之间具有较好的相关性,其拟合曲线分别为:Y(IPMA,TCID50/mL)=23.629X-536174(qPCR,拷贝/mL)(R2=0.996)、Y(IFA,TCID50/mL)=20.318X-575062(qPCR,拷贝/mL)(R2=0.995)和Y(IPMA,TCID50/mL)=1.161X-1176(IFA,TCID50/mL)(R2=0.999).结果表明,GCRV-Ⅱ病毒滴度的测定,除了用IPMA和IFA外,也可以采用qPCR方法通过测定病毒的核酸拷贝数来测算其病毒滴度.
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