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摘要本实验选择公共卫生间马桶垫及洗手盆表面随机样本，进行表面微生物污染的检测。采集样本后，进行细菌分离、纯化培养，形态学观察，记录细菌颜色、形态、大小与数量；将细菌进行16SrDNA检测，测定细菌DNA序列并在NCBI上查出细菌种类。最后整理数据，得到马桶垫上的细菌个数、种类，并分析微生物污染情况及其对人们健康的影响。
关键词微生物污染 16SrDNA检测 公共卫生
微生物污染是主要传染性疾病的源头，包含食品微生物污染、空气微生物污染、水体微生物污染等方面。在日常生活、工作环境中存在在着种类繁多、数量巨大的微生物。它们无处不在，而人们光凭肉眼无法看到，这就使得人们很容易忽视它们所造成的污染，对微生物污染的防范措施不够系统，导致对生活环境及人类健康造成影响。探究不同环境下微生物的污染是目前探究环境污染的重要课题之一，了解工作、生活环境中卫生物污染的现状，对人们提高公共环境卫生保护意识和减少传染病的发生与传播有着重大的意义。
1材料和方法
1.1样品的采集
（1）采样地点：武汉病毒研究所一号楼公共卫生间马桶垫、洗手盆。
（2）采样方法：于50 mL离心管中放置10 mL质量分数为8.5%的生理盐水；用5x5 cm的标准灭菌规格板放在被检物体表面，用镊子夹住浸有无菌生理盐水液的脱脂棉，在规格板内横竖往返各涂抹5次，并随之转动脱脂棉、连续采样3个规格板面积；将脱脂棉于放入装10 mL采样液的试管中，盖上盖子，4～C保存。
1.2细菌的分离与纯化
（1）移液器移取浸泡样品生理盐水100μL于LB固体培养基平板中，三角玻棒消毒后，将样品在培养基表面上均匀涂布；倒置平板，放入37℃恒温培养箱中，培养24h后取出，计数。
（2）选择不同形态的菌落进行划线培养并记录细菌群落的大小、形状、表面与边缘的模样、颜色等。
（3）接种环挑取单菌落，交叉划线法在新的LB平板上划线，放入37℃恒温培养箱中，培养24 h后取出得到各个细菌的纯培养物。
1.3细菌的16S rDNA序列鉴定
1.3.1实验试剂
溶菌酶（20 mg/mL）、超纯水、PCR mix（2xTS-INGKE MasterMix）、琼脂糖、引物（表1）。
1.3.2实验方法
1.3.2.1核酸提取
1.3.2.2基因扩增
（1）基因扩增体系见表2。
（2）基因扩增程序见表3。
（3）电泳检测
称取1g琼脂糖置于100 mL TAE电泳缓冲液中，加热融化，待温度降至60℃左右时，均匀铺板，制成1%的琼脂糖凝胶。PCR反应结束后，加样，以100V电压进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，染色，用凝胶成像仪观察，拍照，记录实验结果。
2实验结果
2.1样品的采集
本实验共采集6份样品（表4）。
2.2细菌的分离与纯化
（1）对所采样品分所得细菌总数进行统计，结果见表5。
（2）计算公式：细菌菌落总数（efu/100c㎡）（物体表面微生物污染）：物体表面菌落数=平皿上菌落的平均数×采样液体稀释倍数/采样面积（c㎡）。
通过计算，得马桶，洗手台细菌数（表6）。
2.3细菌的16SrDNA序列鉴定
2.3.1部分电泳检测结果
PCR部分检测结果如图1所示。
在实验过程中，有一部分分离纯化所得细菌并未检测到16S rDNA片段，可能是未成功提取到基因组DNA的原因，后期可再提取DNA，重新扩增。
2.3.2测序统计结果
16S rDNA测序鉴定结果见表7。
由鉴定结果可知，在马桶垫上，比较常见的菌属为芽孢杆菌属，其中部分细菌对人类健康有不同程度的危害。例如梭形芽孢杆菌可引起腹泻，严重的会导致低白蛋白血症，婴幼儿等免疫力低下人群易感染患病；蜡样芽孢杆菌可引起呕吐、腹泻；雷氏普罗维登斯菌也是马桶中的主要的细菌，虽然其引发的感染十分少见，但其可以引起败血症等严重的疾病；松鼠葡萄球菌，可以引起尿道感染、心内膜炎、腹膜炎等疾病。
洗手台内，比较常见的细菌为蜡样芽孢杆菌（可引起呕吐、腹泻），还有一些芽孢杆菌属下其它的病原菌。相对于马桶而言，洗手台表面的病原菌数量少、致病性弱，但也存在大量引起呕吐、腹泻的蜡样芽胞杆菌。
3讨论
本次实验是在病毒研究所一号大楼内进行，选取的采样地点均是工作人员日常接触最频繁的区域。大楼内的卫生间有定期的清洁和消毒，但从此次实验的结果中可以看到，即便是清洁后的地方仍然會存在大量的细菌，其中还包含有不少病原菌。为了公众的健康，预防各类传染疾病，人们应该提高对公共区域清洁消毒工作的重视，创造一个洁净卫生的工作、生活环境。
任何地方都会存在着不同程度的微生物污染，它们对人类最大的影响就是会引发各种疾病，所以要做到时刻注意自己的卫生与身体的健康状况，尽最大可能防止微生物污染对身体的影响。
关键词微生物污染 16SrDNA检测 公共卫生
微生物污染是主要传染性疾病的源头，包含食品微生物污染、空气微生物污染、水体微生物污染等方面。在日常生活、工作环境中存在在着种类繁多、数量巨大的微生物。它们无处不在，而人们光凭肉眼无法看到，这就使得人们很容易忽视它们所造成的污染，对微生物污染的防范措施不够系统，导致对生活环境及人类健康造成影响。探究不同环境下微生物的污染是目前探究环境污染的重要课题之一，了解工作、生活环境中卫生物污染的现状，对人们提高公共环境卫生保护意识和减少传染病的发生与传播有着重大的意义。
1材料和方法
1.1样品的采集
（1）采样地点：武汉病毒研究所一号楼公共卫生间马桶垫、洗手盆。
（2）采样方法：于50 mL离心管中放置10 mL质量分数为8.5%的生理盐水；用5x5 cm的标准灭菌规格板放在被检物体表面，用镊子夹住浸有无菌生理盐水液的脱脂棉，在规格板内横竖往返各涂抹5次，并随之转动脱脂棉、连续采样3个规格板面积；将脱脂棉于放入装10 mL采样液的试管中，盖上盖子，4～C保存。
1.2细菌的分离与纯化
（1）移液器移取浸泡样品生理盐水100μL于LB固体培养基平板中，三角玻棒消毒后，将样品在培养基表面上均匀涂布；倒置平板，放入37℃恒温培养箱中，培养24h后取出，计数。
（2）选择不同形态的菌落进行划线培养并记录细菌群落的大小、形状、表面与边缘的模样、颜色等。
（3）接种环挑取单菌落，交叉划线法在新的LB平板上划线，放入37℃恒温培养箱中，培养24 h后取出得到各个细菌的纯培养物。
1.3细菌的16S rDNA序列鉴定
1.3.1实验试剂
溶菌酶（20 mg/mL）、超纯水、PCR mix（2xTS-INGKE MasterMix）、琼脂糖、引物（表1）。
1.3.2实验方法
1.3.2.1核酸提取
1.3.2.2基因扩增
（1）基因扩增体系见表2。
（2）基因扩增程序见表3。
（3）电泳检测
称取1g琼脂糖置于100 mL TAE电泳缓冲液中，加热融化，待温度降至60℃左右时，均匀铺板，制成1%的琼脂糖凝胶。PCR反应结束后，加样，以100V电压进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，染色，用凝胶成像仪观察，拍照，记录实验结果。
2实验结果
2.1样品的采集
本实验共采集6份样品（表4）。
2.2细菌的分离与纯化
（1）对所采样品分所得细菌总数进行统计，结果见表5。
（2）计算公式：细菌菌落总数（efu/100c㎡）（物体表面微生物污染）：物体表面菌落数=平皿上菌落的平均数×采样液体稀释倍数/采样面积（c㎡）。
通过计算，得马桶，洗手台细菌数（表6）。
2.3细菌的16SrDNA序列鉴定
2.3.1部分电泳检测结果
PCR部分检测结果如图1所示。
在实验过程中，有一部分分离纯化所得细菌并未检测到16S rDNA片段，可能是未成功提取到基因组DNA的原因，后期可再提取DNA，重新扩增。
2.3.2测序统计结果
16S rDNA测序鉴定结果见表7。
由鉴定结果可知，在马桶垫上，比较常见的菌属为芽孢杆菌属，其中部分细菌对人类健康有不同程度的危害。例如梭形芽孢杆菌可引起腹泻，严重的会导致低白蛋白血症，婴幼儿等免疫力低下人群易感染患病；蜡样芽孢杆菌可引起呕吐、腹泻；雷氏普罗维登斯菌也是马桶中的主要的细菌，虽然其引发的感染十分少见，但其可以引起败血症等严重的疾病；松鼠葡萄球菌，可以引起尿道感染、心内膜炎、腹膜炎等疾病。
洗手台内，比较常见的细菌为蜡样芽孢杆菌（可引起呕吐、腹泻），还有一些芽孢杆菌属下其它的病原菌。相对于马桶而言，洗手台表面的病原菌数量少、致病性弱，但也存在大量引起呕吐、腹泻的蜡样芽胞杆菌。
3讨论
本次实验是在病毒研究所一号大楼内进行，选取的采样地点均是工作人员日常接触最频繁的区域。大楼内的卫生间有定期的清洁和消毒，但从此次实验的结果中可以看到，即便是清洁后的地方仍然會存在大量的细菌，其中还包含有不少病原菌。为了公众的健康，预防各类传染疾病，人们应该提高对公共区域清洁消毒工作的重视，创造一个洁净卫生的工作、生活环境。
任何地方都会存在着不同程度的微生物污染，它们对人类最大的影响就是会引发各种疾病，所以要做到时刻注意自己的卫生与身体的健康状况，尽最大可能防止微生物污染对身体的影响。