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摘要 建立高效液相色谱法（HPLC）同时测定饲料中乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮3种药物含量的方法，饲料中3种药物经磷酸盐缓冲液（pH值3.0）-乙腈-甲醇（55∶25∶20）超声提取，采用Waters公司C18（4.6×250mm，5μm）色谱柱，流速1.0mL/min，进样量20μL，柱温24℃，检测波长260nm。该色谱条件下，3种药物分离良好，在2～100μg/mL之间，线性良好（r＞0.999 6），平均添加回收率均高于80%，RSD≤10%，检出限2mg/kg。该方法操作简便易行，准确可靠，能够满足实际样品的分析要求。
关键词 饲料药物测定；乙酰甲喹；喹乙醇；喹烯酮；高效液相色谱法
中图分类号 S816.17文献标识码A文章编号 1007-5739（2008）24-0230-01
喹乙醇、乙酰甲喹和喹烯酮是喹噁啉类合成抑菌药物，该类药物具有抗菌效果好、促生长、价格便宜等优点，被广泛添加到饲料中用于生产养殖，但由于不正确使用，中毒事件时有发生，同时该类药物的残留对人体具有潜在致癌性和产生抗药性的可能，国际上大多数国家将其列为限用药物。我国对饲料中喹乙醇、乙酰甲喹和喹烯酮单个检测研究较多，但对于饲料中3种药物多残留检测方法研究较少。因此，建立一种准确、高效地同时测定饲料中3种药物多残留的检测方法十分必要。试验采用高效液相色谱法同时测定饲料中乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮3种药物，该方法的建立将为饲料产品中其他喹噁啉类药物多残留检测提供参考。
1 材料与方法
1.1药品、试剂
喹乙醇、乙酰甲喹、 喹烯酮对照品（纯度>98%）均购自中国兽医药品监察所；乙腈、甲醇：色谱纯，美国Fisher Chemical公司；二甲基甲酰胺、三乙胺、85%磷酸均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Agilent 1100高效液相色谱仪（二极管阵列检测器）；十万分之一天平、pH酸度计（赛多利斯公司）；离心机（日立公司）；超声波仪（江苏昆山市超声仪器有限公司）；超纯水器（成都康林公司）。
1.3 色谱条件
色谱柱：Waters公司C18（4.6×250mm，5μm）；流动相：磷酸盐缓冲液（5mL 85%磷酸稀释到1 000mL，用三乙胺调pH值3.0）-乙腈-甲醇（55∶25∶20）；流速1.0mL/min，进样量20μL，检测波长260nm。
1.4 样品的处理
精密称取5.0g饲料试样，置于具塞锥形瓶中，精密加入50mL流动相，超声波提取3min（避光操作），将试样提取液倒入离心管中，3 000rpm离心15min。取上清液用0.45μm滤膜过滤，滤液作为试样溶液，待用。
2结果与分析
2.1线性关系
精密称取喹乙醇、乙酰甲喹、喹烯酮对照品各50mg于100mL棕色容量瓶，加二甲基甲酰胺10mL，加入流动相至刻度，超声摇匀作为储备液。用流动相稀释储备液成2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的标准工作液，按1.3色谱条件，分别以乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮各浓度峰面积（A）与相对应浓度（C）得到标准曲线的线性方程、相关系数结果见表1，3种对照品混合液色谱图见图1。
2.5样品的测定
按1.3色谱条件，将待测样品上机测定，记录色谱图，按标准曲线法计算。
3 讨论
3.1检测环境的影响
乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮受环境温度、湿度影响不大，但对光敏感，强光易使样品分解，使有杂质峰出现。因此，样品处理需在光线弱处操作。
3.2 样品的处理方法
有报告[1]称以三氯甲烷-甲醇溶液作为提取液，用恒温振荡方法提取后用waters HLB小柱纯化，结果发现喹烯酮色谱峰的峰型展宽，峰型分裂成双峰，用HLB小柱成本高，而用流动相作为提取液，采用超声波提取，不仅色谱峰为尖锐对称峰，提取成本低，时间短，操作简便，而且能消除溶剂干扰。
3.3 测定波长的选择
有文献报道[2]采用380nm测定，3种物质在此波长下灵敏度非常低，此波长接近可见光400nm，考虑到饲料成分复杂，选择260nm作为测定波长，结果3种物质色谱峰型窄，峰响应值高，满足分析要求。
3.4 流动相的选择与优化
根据乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮分子的结构，分子中酰胺键、醇羟基有电负性较强的氧元素，因此与水、醇有较强的氢键结合力，甲醇、乙腈、水应是较理想的流动相。本试验分别考察了甲醇-水体系和乙腈-水体系分离情况，当流动相中乙腈比例大于30%时，流动相极性变小，保留时间提前，分离度变小，乙酰甲喹与喹乙醇峰型重叠，只获得部分分离。在流动相加入一定量的乙腈，分离因子和分离度明显增加，乙酰甲喹与喹乙醇完全分离，且喹烯酮保留时间明显提前，适合多组分分离；添加不同量三乙胺调节溶液pH值，对峰型、保留时间进行调整，随着pH值减小，分离因子以及分离度的变化趋势明显，当pH值为3.0，乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮完全分开，峰型对称，出峰时间比较理想，说明流动相中pH值的改变对溶质分离有实质影响。
4 结论
试验采用高效液相色谱法同时测定饲料中乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮3种药物，通过对检测波长、提取方法、流动相进行选择与优化，应用实际样品检测，该方法操作简便易行，快速准确，节约测试成本，可为饲料产品中其他喹噁啉类药物残留检测提供参考。
5 参考文献
[1] 刘元元，张丽芳，邹思湘，等.高效液相色谱法测定鱼饲料中的喹烯酮[J].畜牧与兽医,2007，39（1）：35-37.
[2] 欧阳华学，雷华越，汪开毓.测定饲料中喹乙醇含量的反相高效液相色谱法[J].分析测试学报，2002（3）：73-75.
关键词 饲料药物测定；乙酰甲喹；喹乙醇；喹烯酮；高效液相色谱法
中图分类号 S816.17文献标识码A文章编号 1007-5739（2008）24-0230-01
喹乙醇、乙酰甲喹和喹烯酮是喹噁啉类合成抑菌药物，该类药物具有抗菌效果好、促生长、价格便宜等优点，被广泛添加到饲料中用于生产养殖，但由于不正确使用，中毒事件时有发生，同时该类药物的残留对人体具有潜在致癌性和产生抗药性的可能，国际上大多数国家将其列为限用药物。我国对饲料中喹乙醇、乙酰甲喹和喹烯酮单个检测研究较多，但对于饲料中3种药物多残留检测方法研究较少。因此，建立一种准确、高效地同时测定饲料中3种药物多残留的检测方法十分必要。试验采用高效液相色谱法同时测定饲料中乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮3种药物，该方法的建立将为饲料产品中其他喹噁啉类药物多残留检测提供参考。
1 材料与方法
1.1药品、试剂
喹乙醇、乙酰甲喹、 喹烯酮对照品（纯度>98%）均购自中国兽医药品监察所；乙腈、甲醇：色谱纯，美国Fisher Chemical公司；二甲基甲酰胺、三乙胺、85%磷酸均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Agilent 1100高效液相色谱仪（二极管阵列检测器）；十万分之一天平、pH酸度计（赛多利斯公司）；离心机（日立公司）；超声波仪（江苏昆山市超声仪器有限公司）；超纯水器（成都康林公司）。
1.3 色谱条件
色谱柱：Waters公司C18（4.6×250mm，5μm）；流动相：磷酸盐缓冲液（5mL 85%磷酸稀释到1 000mL，用三乙胺调pH值3.0）-乙腈-甲醇（55∶25∶20）；流速1.0mL/min，进样量20μL，检测波长260nm。
1.4 样品的处理
精密称取5.0g饲料试样，置于具塞锥形瓶中，精密加入50mL流动相，超声波提取3min（避光操作），将试样提取液倒入离心管中，3 000rpm离心15min。取上清液用0.45μm滤膜过滤，滤液作为试样溶液，待用。
2结果与分析
2.1线性关系
精密称取喹乙醇、乙酰甲喹、喹烯酮对照品各50mg于100mL棕色容量瓶，加二甲基甲酰胺10mL，加入流动相至刻度，超声摇匀作为储备液。用流动相稀释储备液成2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的标准工作液，按1.3色谱条件，分别以乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮各浓度峰面积（A）与相对应浓度（C）得到标准曲线的线性方程、相关系数结果见表1，3种对照品混合液色谱图见图1。
2.5样品的测定
按1.3色谱条件，将待测样品上机测定，记录色谱图，按标准曲线法计算。
3 讨论
3.1检测环境的影响
乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮受环境温度、湿度影响不大，但对光敏感，强光易使样品分解，使有杂质峰出现。因此，样品处理需在光线弱处操作。
3.2 样品的处理方法
有报告[1]称以三氯甲烷-甲醇溶液作为提取液，用恒温振荡方法提取后用waters HLB小柱纯化，结果发现喹烯酮色谱峰的峰型展宽，峰型分裂成双峰，用HLB小柱成本高，而用流动相作为提取液，采用超声波提取，不仅色谱峰为尖锐对称峰，提取成本低，时间短，操作简便，而且能消除溶剂干扰。
3.3 测定波长的选择
有文献报道[2]采用380nm测定，3种物质在此波长下灵敏度非常低，此波长接近可见光400nm，考虑到饲料成分复杂，选择260nm作为测定波长，结果3种物质色谱峰型窄，峰响应值高，满足分析要求。
3.4 流动相的选择与优化
根据乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮分子的结构，分子中酰胺键、醇羟基有电负性较强的氧元素，因此与水、醇有较强的氢键结合力，甲醇、乙腈、水应是较理想的流动相。本试验分别考察了甲醇-水体系和乙腈-水体系分离情况，当流动相中乙腈比例大于30%时，流动相极性变小，保留时间提前，分离度变小，乙酰甲喹与喹乙醇峰型重叠，只获得部分分离。在流动相加入一定量的乙腈，分离因子和分离度明显增加，乙酰甲喹与喹乙醇完全分离，且喹烯酮保留时间明显提前，适合多组分分离；添加不同量三乙胺调节溶液pH值，对峰型、保留时间进行调整，随着pH值减小，分离因子以及分离度的变化趋势明显，当pH值为3.0，乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮完全分开，峰型对称，出峰时间比较理想，说明流动相中pH值的改变对溶质分离有实质影响。
4 结论
试验采用高效液相色谱法同时测定饲料中乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮3种药物，通过对检测波长、提取方法、流动相进行选择与优化，应用实际样品检测，该方法操作简便易行，快速准确，节约测试成本，可为饲料产品中其他喹噁啉类药物残留检测提供参考。
5 参考文献
[1] 刘元元，张丽芳，邹思湘，等.高效液相色谱法测定鱼饲料中的喹烯酮[J].畜牧与兽医,2007，39（1）：35-37.
[2] 欧阳华学，雷华越，汪开毓.测定饲料中喹乙醇含量的反相高效液相色谱法[J].分析测试学报，2002（3）：73-75.