【摘 要】
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【背景】16S rRNA基因扩增子测序技术是一种不依赖培养的方法，可以获得样本中细菌种群结构、相对丰度等信息。高通量测序技术实验步骤较多，每一步骤细微的差别都可能在最终的测序结果中放大，并造成测序结果与实际情况的偏差。【目的】基于MiSeq测序平台，探讨PCR反应体系中扩增引物序列、退火温度、起始模板量、扩增循环数和变性时间等五个因素对16S rRNA基因测序结果的影响。【方法】对Mock DNA
【基金项目】
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科技基础资源调查专项（2021FY100901）；
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【背景】16S rRNA基因扩增子测序技术是一种不依赖培养的方法，可以获得样本中细菌种群结构、相对丰度等信息。高通量测序技术实验步骤较多，每一步骤细微的差别都可能在最终的测序结果中放大，并造成测序结果与实际情况的偏差。【目的】基于MiSeq测序平台，探讨PCR反应体系中扩增引物序列、退火温度、起始模板量、扩增循环数和变性时间等五个因素对16S rRNA基因测序结果的影响。【方法】对Mock DNA的16S rRNA基因扩增子进行测序，分别分析不同的扩增引物、退火温度、模板起始量、循环数和变性时间对数据准确性的影响。【结果】不同的扩增引物对检测结果有较大的影响，采用的4组引物中，引物B（V3-V4，341F/806R）的准确性最好，引物A（V3-V4，341F/805R）次之。比较不同退火温度（52 ℃，55 ℃和60 ℃）对检测准确性的影响，退火温度60℃的结果最接近理论值。起始模板量（2 ng、10 ng和50 ng）的检测结果显示，Mock DNA起始量为2 ng的结果准确性最高。循环数为（20+8）的检测结果相对于其他3组（15+18、25+8和30+8），最接近Mock DNA的理论值。不同变性时间（3 min和5 min），对分析结果无显著性影响。【结论】引物序列、退火温度、起始模板量和循环数是影响16S rRNA基因测序结果准确性的重要因素。
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