目的:建立应用超高效液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱仪(UPLC-ESI-MS/MS),多离子反应监测(MRM)法测定牛奶中19种β-内酰胺类抗生素(包括阿莫西林、氨苄西林、美洛西林、派拉西林、青霉素G、甲氧西林、青霉素V、非奈西林、苯唑西林、双氯唑西林、氯唑西林、奈夫西林等12种青霉素类和头孢匹林、头孢氨苄、头孢拉定、头孢唑啉、头孢派酮、头孢噻呋、头孢噻吩等7种头孢类)的快速确认方法。方法:使用青霉素G-D7为内标,样品经沉淀蛋白、离心后,用HLB-SPE柱富集、净化处理,在ACQUITY UPLCTMBEH SHELD RP18色谱柱(2.1×100 mm,粒径1.7μm)中分离,以0.1%的甲酸水溶液/乙腈为流动相,经梯度洗脱将19种β-内酰胺类抗生素完全分离;采用正离子扫描或负离子扫描的方式确定丰度比最高的2对离子作为监测离子,进行MRM模式定性定量分析。结果:上述19种β-内酰胺类抗生素的最低检出限(LOD)为0.01~0.3μg/L,定量限(LOQ)为0.034~1.144μg/L,在0.01~200μg/L的线性范围,相关系数r均大于0.99。低、中、高三水平(μg/L)加标回收率分别为73.4%~112.7%、75.7%~103.1%、80.0%~103.6%,相对标准偏差分别为4.3%~17.4%、2.9%~15.2%、1.8%~9.2%。结论:本法操作简单,灵敏度高,可用于牛奶中19种β-内酰胺类抗生素残留的测定。