论文部分内容阅读
【摘 要】目的：研究二烯丙基二硫（Diallyl disulfide，DADS）诱导人髓系白血病细胞株HL-60细胞周期阻滞的分子机制。方法：用不同浓度的DADS处理HL-60细胞0，6，12，24，48 h后，用MTT法、细胞集落培养检测细胞增殖活性；用流式细胞术和有丝分裂指数检测细胞增殖周期；蛋白印迹法检测细胞内p53、p21、及Cdc2激酶的表達和磷酸化水平。结果：不同浓度的DADS对HL-60细胞增殖均有抑制作用，抑制率随着浓度明显增加，且有组间差异（P<0.05），20 ?M DADS与10 nM ATRA抑制细胞增殖活性相近（P>0.05）；20?MDADS处理HL-60细胞12h后出现细胞周期G2/M期阻滞，此时细胞有丝分裂指数明显下降（P<0.05）；同时，p53表达没有改变而p21及磷酸化cdc2蛋白表达明显增加（P<0.05）。结论：DADS能诱导人髓系白血病细胞株HL-60细胞增殖周期G2/M期阻滞，p21的活化及cdc2磷酸化可能是DADS诱导细胞周期阻滞的分子机制之一。
【关键词】二烯丙基二硫；p21； cdc2； p53； HL-60细胞
【中图分类号】R733 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0046—01
大量的流行病学调查表明，大蒜产区以及长期食用大蒜的人群其癌症发生率远低于对照人群，并可以明显减少癌症的发生率与死亡率[1]。现代药物化学研究证明，大蒜内含硫成分多达20余种，其中对癌症起防治作用的二烯丙基二硫（DADS）为大蒜的主要成分之一。最近我们的研究表明，DADS能抑制HL-60细胞增殖，但其分子调控机制未完全阐明。为此，我们以人髓系白血病细胞株HL-60细胞为模型，探讨DADS对HL-60细胞增殖及在细胞增殖周期中起关键作用的p53、p21、cdc2的影响，探讨其抗肿瘤机制。
1 材料与方法
1.1 材料
鼠抗人p21、p53、cdc2磷酸化单克隆抗体均为Santa Cruz公司产品，抗鼠的二抗为博士德公司产品，BCA蛋白检测试剂盒与western-blot荧光检测试剂盒购自Hyclone-Pierce公司，四甲基偶氮唑盐（MTT）与全反式维甲双酸（ATRA）均为sigma公司产品，DADS为Fluka公司产品，二甲基亚砜（DMSO）溶解配制，DMSO终浓度<0.05﹪。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养：人白血病HL-60细胞系由湘雅医学院肿瘤所提供。用含有10%灭活胎牛血清的RPMI1640培养液，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养，取对数生长期细胞进行实验。
1.2.2 细胞集落形成试验：收集细胞接种在24孔培养板内，设置对照组（DMSO）及5，10，20?M浓度的3个加药组，每组设3个复孔，每孔细胞数3×102个。加入含10%灭活胎牛血清的培养基100μl，甲基纤维素终浓度为0.7%，培养至第6～10d时计细胞集落数，以>40个细胞数为1个集落，集落形成率=（集落数/接种细胞数）×100%。
1.2.3 MTT法：取对数生长期细胞接植于96孔塑料培养板，每孔100μl，培养24h后，分别给予不同浓度DADS（5～80μΜ），同时设对照组和调零组。每孔加入10%MTT20μl，继续孵育6h，弃去培养基，加入200?lDMSO终止。然后再振荡15 min，待紫色结晶完全溶解后，置450型ELISA-Reader酶标仪测定A570nm值。细胞生长抑制率按如下公式计算：细胞生长抑制率（IR）=（ 1-实验组OD570值/对照组OD570值）×100%。
1.2.4 流式细胞仪分析：接种5×105/mL细胞悬液于100mL玻璃培养瓶，培养24h后，加（或不加）20?M DADS，再分别培养6h、12h、18h、24h后，收集细胞，1000g离心5min，弃上清，冷PBS洗涤，反复三次后，用预冷的70%乙醇固定。把固定12h以上的细胞加入15?l RNase A （10g/L）作用3～5分钟，再加入400?L碘化丙啶（50mg/L）4℃避光染色30min，在流式细胞仪上进行细胞周期检测，分析细胞周期各时相细胞所占百分率的变化。共重复3次，计算均数后进行比较。
1.2.5 有丝分裂指数测定：细胞接植于6孔塑料培养板中，每孔细胞数为3×104/ml，置37℃细胞培养箱中培育24小时，然后加不同浓度的DADS，收集细胞，1000g离心5min，95%乙醇固定5min后于显微镜下计数，计算每1000个细胞有丝分裂相平均数所占百分比即为有丝分裂指数。
1.3 统计学方法
采用SPSS13.0for Windows统计软件进行分析，实验数据用x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05判定为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 DADS对HL-60细胞增殖的影响
细胞集落形成试验显示：未加药组集落集落形成率为13.71%。加药组集落形成率明显下降，5、10、20μM组集落形成率分别为8.9%、3.75%、1.62%。结果提示：不同浓度的DADS可显著抑制HL-60细胞集落的形成。MTT法检测结果显示：用不同浓度DADS（5、10、20、40、80?M）处理HL-60细胞72h后，其生长抑制率分别为6.8%、20.7%、30.3%、37.5%、45.8%，与对照组比较均具有显著性差异（P<0.05）。方差分析显示，各浓度组之间均有显著性差异且呈明显的浓度依赖关系（P<0.05），说明DADS呈浓度依赖性抑制HL-60细胞增殖。同时结果显示10nmol/LATRA处理细胞后，细胞活性分别下降了29.1%，说明20μMDADS与10nmol/LATRA对HL-60细胞抑制效应相近（P>0.05）。 2.2 DADS对HL-60细胞周期的影响
为了解DADS对HL-60细胞周期的影响，用流式细胞计数，观察DADS处理HL-60细胞周期的变化。结果显示：HL-60细胞经20μM DADS分别作用0h、6h、12h、18h、24h，HL-60细胞G0/G1期细胞百分数平均值分別为30.7%、26.2%、40.1%、37.3%、39.1%，而G2/M期细胞百分数平均值分别为15.0%、16.8%、37.6%、17.4%、15.4%（表1）。即当用DADS处理HL-60细胞12h时，其G2/M期细胞百分数上升到最大值为37.6%（P<0.05）。有丝分裂指数测定显示：随着时间的延长（0，12，24，48，72h），DADS处理组的分裂指数分别为16.02%、1.21%、8.53%%、l3.27%、15.99%，（相应空白对照组为15.53 %、l4.31%、13.76%、14.85%、16.01%）。即DADS作用HL-60细胞12 h时，HL-60细胞G2/M期细胞百分数上升为37.6，而分裂指数下降为1.21。这些结果提示：DADS能诱导HL-60细胞增殖周期阻滞于G2/M期。
2.3 DADS对p53、p21表达和Cdc2磷酸化的影响
蛋白免疫印迹检测显示：20μM DADS处理HL-60细胞后，随着作用时间的延长，p21蛋白表达量明显增加，在DADS作用12 h时，p21表达最强，随后逐渐降低。在DADS处理HL-60细胞12 h时，cdc2的磷酸化水平亦较高，而p53蛋白表达量无明显改变。这些结果提示：p21、cdc2在DADS活化HL-60细胞G2/M检查点过程中发挥重要作用。
3 讨论
近年来大量实验研究表明，大蒜及其提取物具有抗微生物感染、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等多种药理作用。目前已经从大蒜中提取出多种具有药理作用的单体化合物，其中以DADS在防癌、抗癌方面的作用尤为明显，我们的前期研究与本实验显示，DADS呈浓度依赖性抑制人髓系白血病HL-60细胞增殖，20μMDADS抑制增殖效应与10nMATRA效应相当。流式细胞计数技术和细胞有丝分裂指数检测结果表明：20μMDADS处理HL-60细胞后，G2/M期细胞比例逐渐升高，在12h时达到最大（37.6%）。提示：DADS能诱导HL-60细胞周期阻滞在G2/M期。文献报道：细胞周期G2/M期阻滞与p34cdc2激酶的活性、p21密切相关。
p34cdc2激酶是细胞进入有丝分裂的始动因素，它的活化是引发DNA复制以及有丝分裂的主要信号。近年来对DADS研究表明，它能影响p34cdc2激酶活性，启动细胞周期G2/M期阻滞。本实验结果表明：DADS可诱导Cdc2磷酸化水平增高，抑制Cdc2激酶活性，阻止HL-60细胞进入有丝分裂。
p21是MPF（cdc2/cyclinB1）活性的重要调节因子，是细胞周期中重要的调控因子。细胞增殖周期中有两个必需因子为p21作用并抑制，该两因子为cyclin/cdk以及DNA复制必需因子PCNA-DNA聚合酶δ的亚单位。p21蛋白N端抑制cyclin/cdk，而C端抑制PCNA。p21WAF1主要参与细胞周期G1期检测点的调控。Tomoaki A等发现细胞在遭受DNA损伤时，形成p21/PCNA/cdc2/cyclinB1复合物可竞争性抑制Cdc25C与PCAN相结合，因而阻断Cdc25C去磷酸cdc2[2]。本实验结果显示：DADS处理HL-60细胞12h，p53表达水平未发生改变而p21表达达到高峰；同时，cdc2磷酸化水平增高。这些结果提示：DADS通过非p53依赖途径诱导p21的高表达，阻断cdc2的去磷酸化来抑制cdc2激酶的活性，诱导HL-60细胞周期G2/M期阻滞。
本实验仅研究与细胞周期相关的部分蛋白在DADS诱导HL-60细胞周期G2/M期阻滞中的表达变化， 还需进一步研究蛋白与蛋白之间的相互作用， 以明确DADS诱导HL-60细胞周期阻滞的具体信号通路， 从而找出DADS抗肿瘤的靶点。由于DADS的毒性较低，对多种肿瘤细胞均有抑制作用，深入研究它的抗肿瘤机制对将来DADS的临床应用有重要意义。
参考文献：
[1] Milner JA. A historical perspective on garlic and cancer[J]. J Nutr， 2001， 131：1027-1031.
[2] Tomoaki A， Kawabe T， Ohara H， et al. Involvement of the interaction between p21 and proliferating cell nuclear antigen for the maintenance of G2/M arrest after DNA damage[J]. J Bio Chem， 2001， 276（46）： 42971～42977.
作者简介：
曾勇智（1971-）男，讲师，硕士，药理学专业。
本文课题受湖南省卫生厅课题资助（编号：B2010-041）
【关键词】二烯丙基二硫；p21； cdc2； p53； HL-60细胞
【中图分类号】R733 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0046—01
大量的流行病学调查表明，大蒜产区以及长期食用大蒜的人群其癌症发生率远低于对照人群，并可以明显减少癌症的发生率与死亡率[1]。现代药物化学研究证明，大蒜内含硫成分多达20余种，其中对癌症起防治作用的二烯丙基二硫（DADS）为大蒜的主要成分之一。最近我们的研究表明，DADS能抑制HL-60细胞增殖，但其分子调控机制未完全阐明。为此，我们以人髓系白血病细胞株HL-60细胞为模型，探讨DADS对HL-60细胞增殖及在细胞增殖周期中起关键作用的p53、p21、cdc2的影响，探讨其抗肿瘤机制。
1 材料与方法
1.1 材料
鼠抗人p21、p53、cdc2磷酸化单克隆抗体均为Santa Cruz公司产品，抗鼠的二抗为博士德公司产品，BCA蛋白检测试剂盒与western-blot荧光检测试剂盒购自Hyclone-Pierce公司，四甲基偶氮唑盐（MTT）与全反式维甲双酸（ATRA）均为sigma公司产品，DADS为Fluka公司产品，二甲基亚砜（DMSO）溶解配制，DMSO终浓度<0.05﹪。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养：人白血病HL-60细胞系由湘雅医学院肿瘤所提供。用含有10%灭活胎牛血清的RPMI1640培养液，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养，取对数生长期细胞进行实验。
1.2.2 细胞集落形成试验：收集细胞接种在24孔培养板内，设置对照组（DMSO）及5，10，20?M浓度的3个加药组，每组设3个复孔，每孔细胞数3×102个。加入含10%灭活胎牛血清的培养基100μl，甲基纤维素终浓度为0.7%，培养至第6～10d时计细胞集落数，以>40个细胞数为1个集落，集落形成率=（集落数/接种细胞数）×100%。
1.2.3 MTT法：取对数生长期细胞接植于96孔塑料培养板，每孔100μl，培养24h后，分别给予不同浓度DADS（5～80μΜ），同时设对照组和调零组。每孔加入10%MTT20μl，继续孵育6h，弃去培养基，加入200?lDMSO终止。然后再振荡15 min，待紫色结晶完全溶解后，置450型ELISA-Reader酶标仪测定A570nm值。细胞生长抑制率按如下公式计算：细胞生长抑制率（IR）=（ 1-实验组OD570值/对照组OD570值）×100%。
1.2.4 流式细胞仪分析：接种5×105/mL细胞悬液于100mL玻璃培养瓶，培养24h后，加（或不加）20?M DADS，再分别培养6h、12h、18h、24h后，收集细胞，1000g离心5min，弃上清，冷PBS洗涤，反复三次后，用预冷的70%乙醇固定。把固定12h以上的细胞加入15?l RNase A （10g/L）作用3～5分钟，再加入400?L碘化丙啶（50mg/L）4℃避光染色30min，在流式细胞仪上进行细胞周期检测，分析细胞周期各时相细胞所占百分率的变化。共重复3次，计算均数后进行比较。
1.2.5 有丝分裂指数测定：细胞接植于6孔塑料培养板中，每孔细胞数为3×104/ml，置37℃细胞培养箱中培育24小时，然后加不同浓度的DADS，收集细胞，1000g离心5min，95%乙醇固定5min后于显微镜下计数，计算每1000个细胞有丝分裂相平均数所占百分比即为有丝分裂指数。
1.3 统计学方法
采用SPSS13.0for Windows统计软件进行分析，实验数据用x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05判定为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 DADS对HL-60细胞增殖的影响
细胞集落形成试验显示：未加药组集落集落形成率为13.71%。加药组集落形成率明显下降，5、10、20μM组集落形成率分别为8.9%、3.75%、1.62%。结果提示：不同浓度的DADS可显著抑制HL-60细胞集落的形成。MTT法检测结果显示：用不同浓度DADS（5、10、20、40、80?M）处理HL-60细胞72h后，其生长抑制率分别为6.8%、20.7%、30.3%、37.5%、45.8%，与对照组比较均具有显著性差异（P<0.05）。方差分析显示，各浓度组之间均有显著性差异且呈明显的浓度依赖关系（P<0.05），说明DADS呈浓度依赖性抑制HL-60细胞增殖。同时结果显示10nmol/LATRA处理细胞后，细胞活性分别下降了29.1%，说明20μMDADS与10nmol/LATRA对HL-60细胞抑制效应相近（P>0.05）。 2.2 DADS对HL-60细胞周期的影响
为了解DADS对HL-60细胞周期的影响，用流式细胞计数，观察DADS处理HL-60细胞周期的变化。结果显示：HL-60细胞经20μM DADS分别作用0h、6h、12h、18h、24h，HL-60细胞G0/G1期细胞百分数平均值分別为30.7%、26.2%、40.1%、37.3%、39.1%，而G2/M期细胞百分数平均值分别为15.0%、16.8%、37.6%、17.4%、15.4%（表1）。即当用DADS处理HL-60细胞12h时，其G2/M期细胞百分数上升到最大值为37.6%（P<0.05）。有丝分裂指数测定显示：随着时间的延长（0，12，24，48，72h），DADS处理组的分裂指数分别为16.02%、1.21%、8.53%%、l3.27%、15.99%，（相应空白对照组为15.53 %、l4.31%、13.76%、14.85%、16.01%）。即DADS作用HL-60细胞12 h时，HL-60细胞G2/M期细胞百分数上升为37.6，而分裂指数下降为1.21。这些结果提示：DADS能诱导HL-60细胞增殖周期阻滞于G2/M期。
2.3 DADS对p53、p21表达和Cdc2磷酸化的影响
蛋白免疫印迹检测显示：20μM DADS处理HL-60细胞后，随着作用时间的延长，p21蛋白表达量明显增加，在DADS作用12 h时，p21表达最强，随后逐渐降低。在DADS处理HL-60细胞12 h时，cdc2的磷酸化水平亦较高，而p53蛋白表达量无明显改变。这些结果提示：p21、cdc2在DADS活化HL-60细胞G2/M检查点过程中发挥重要作用。
3 讨论
近年来大量实验研究表明，大蒜及其提取物具有抗微生物感染、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等多种药理作用。目前已经从大蒜中提取出多种具有药理作用的单体化合物，其中以DADS在防癌、抗癌方面的作用尤为明显，我们的前期研究与本实验显示，DADS呈浓度依赖性抑制人髓系白血病HL-60细胞增殖，20μMDADS抑制增殖效应与10nMATRA效应相当。流式细胞计数技术和细胞有丝分裂指数检测结果表明：20μMDADS处理HL-60细胞后，G2/M期细胞比例逐渐升高，在12h时达到最大（37.6%）。提示：DADS能诱导HL-60细胞周期阻滞在G2/M期。文献报道：细胞周期G2/M期阻滞与p34cdc2激酶的活性、p21密切相关。
p34cdc2激酶是细胞进入有丝分裂的始动因素，它的活化是引发DNA复制以及有丝分裂的主要信号。近年来对DADS研究表明，它能影响p34cdc2激酶活性，启动细胞周期G2/M期阻滞。本实验结果表明：DADS可诱导Cdc2磷酸化水平增高，抑制Cdc2激酶活性，阻止HL-60细胞进入有丝分裂。
p21是MPF（cdc2/cyclinB1）活性的重要调节因子，是细胞周期中重要的调控因子。细胞增殖周期中有两个必需因子为p21作用并抑制，该两因子为cyclin/cdk以及DNA复制必需因子PCNA-DNA聚合酶δ的亚单位。p21蛋白N端抑制cyclin/cdk，而C端抑制PCNA。p21WAF1主要参与细胞周期G1期检测点的调控。Tomoaki A等发现细胞在遭受DNA损伤时，形成p21/PCNA/cdc2/cyclinB1复合物可竞争性抑制Cdc25C与PCAN相结合，因而阻断Cdc25C去磷酸cdc2[2]。本实验结果显示：DADS处理HL-60细胞12h，p53表达水平未发生改变而p21表达达到高峰；同时，cdc2磷酸化水平增高。这些结果提示：DADS通过非p53依赖途径诱导p21的高表达，阻断cdc2的去磷酸化来抑制cdc2激酶的活性，诱导HL-60细胞周期G2/M期阻滞。
本实验仅研究与细胞周期相关的部分蛋白在DADS诱导HL-60细胞周期G2/M期阻滞中的表达变化， 还需进一步研究蛋白与蛋白之间的相互作用， 以明确DADS诱导HL-60细胞周期阻滞的具体信号通路， 从而找出DADS抗肿瘤的靶点。由于DADS的毒性较低，对多种肿瘤细胞均有抑制作用，深入研究它的抗肿瘤机制对将来DADS的临床应用有重要意义。
参考文献：
[1] Milner JA. A historical perspective on garlic and cancer[J]. J Nutr， 2001， 131：1027-1031.
[2] Tomoaki A， Kawabe T， Ohara H， et al. Involvement of the interaction between p21 and proliferating cell nuclear antigen for the maintenance of G2/M arrest after DNA damage[J]. J Bio Chem， 2001， 276（46）： 42971～42977.
作者简介：
曾勇智（1971-）男，讲师，硕士，药理学专业。
本文课题受湖南省卫生厅课题资助（编号：B2010-041）