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摘 要：从广东省各地采集了54个辣椒疫霉菌株，分别测定了菌丝生长和游动孢子囊形成对嘧菌酯的敏感性。结果表明，嘧菌酯对辣椒疫霉的菌丝生长具有很强的抑制作用，EC50范围为0.142 8～1.950 9 μg／mL，平均为0.964 9 μg／mL；对游动孢子囊形成的抑制作用更强，EC50范围为0.001 0～0.084 4 μg／mL平均为0.023 9 μg／mL。正态分析表明，辣椒疫病菌54个菌株菌丝生长对嘧菌酯的敏感性符合正态分布，而孢子萌发则在高浓度区具有拖尾现象，表明自然界中已存在个别具有一定耐药性的辣椒疫霉种群。
关键词：辣椒疫霉；嘧菌酯；抗药性
中图分类号：S，182．2
辣椒疫病是由辣椒疫霉(Phytohpthora capsici)引起的一种毁灭性土传病害。在世界各地的辣椒种植区普遍发生，我国各辣椒产区疫病大量发生，严重影响了辣椒的产量和品质。辣椒疫霉除了侵染辣椒以外，还可以侵染番茄、茄子、黄瓜、甜瓜、西瓜、南瓜等，病菌侵染后潜育期短，发病快，因而辣椒疫病防治十分困难。目前，防治辣椒疫病主要用化学防治方法，由于辣椒疫霉菌极易对杀菌剂产生抗药性，化学防治的效果常常因为病菌抗药性的提高而大大降低。
在无菌操作条件下，将辣椒感病组织，切成0.5 cm见方的小块，用75％的乙醇对上述小块病组织表面消毒后，用已灭好菌的滤纸、保湿纸和硬纸依次由内到外包好，然后放在d=9 cm铺有滤纸和保湿纸的培养肌中，每皿放3块，在25℃下培养7～15 d，其中每隔3天观察1次并保持病组织块的湿润状态。选取白色霉状物的病组织块，再按照常规方法用次氯酸钠溶液灭菌1 min后，放于选择性培养基上进行培养。
按郑小波的方法，将盛有大量孢子囊的培养皿放入4℃冰箱中10～15 min后，取出置于25℃下30 min，低倍镜下可见大量游动孢子释放．用灭菌吸管吸取孢子悬浮液1～4滴(视孢子浓度而定)涂布于含青霉素、利福平、五氯硝基苯各50 μg／mL的10％V8汁水琼脂平板上，置25℃黑暗培养8～12 h。取出培养皿置于显微镜下观察；切取带有单个已萌发游动孢子的琼脂块置于选择性培养基(含青霉素、利福平、五氯硝基苯各50 μg／mL的LBA培养基(利马豆60 g加水1 000 mL，充分煮沸，4层纱布过滤去渣，滤液补足水至1 000 mL，加入琼脂20 g)平板上，在25℃黑暗中培养2～3 d，可获得纯净的单游动孢子无性系。
1．2 辣椒疫霉菌丝生长对嘧菌酯的敏感性测定
本试验所用的嘧菌酯由先正达公司赠送，为98％原药。原药先用V(甲醇)：V(丙酮)=1：3配制成浓度为100 μg／mL的母液备用。
将疫霉菌接种于LBA培养基平板上，25℃下黑暗培养5 d，用直径4 mm的打孔器在近菌落边缘1／3处打孔，制成接种菌丝圆碟。取适量的嘧菌酯母液，加入溶化后冷却到50℃左右的LBA培养基中，混匀，制成0、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 μg／mL梯度浓度的LBA平板。待培养基冷却后用接种针挑取菌碟，菌面向下接于含毒培养基中心，每皿1块。放入恒温箱中，25℃下培养5 d用十字交叉法测量菌落直径，每处理4皿，试验重复3次。
测量菌落直径，依下式计算不同浓度药剂对疫霉菌菌丝生长抑制率：
计算抑制率几率值和浓度对数值的毒力方程，毒力公式计算嘧菌酯对疫霉菌各菌株的抑制中浓度EC50及相关系数r值。数值统计计算用SAS程序进行。
对54个菌株的EC50进行正态分布检验，确定是否符合正态分布。正态分布检验用SAS程序进行。
1．3 辣椒疫霉游动孢子囊形成对嘧菌酯的敏感性测定
参照Matheron等的方法，从生长在LBA平板上的疫霉菌落边缘1／3处打直径为5 mm的菌碟4块，置于直径为9 cm的培养皿中，加入含有0、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 μg／mL嘧菌酯的无菌水5 mL，使得液面刚刚没过菌丝块，24℃下光暗交替(12 h∥12 h)培养3 d后，倒去无菌水，在菌碟上滴加少许酸性品红，10～15 s后滴加乳酸直至洗去大量品红。游动孢子囊呈现红色，在菌碟上随机挑取3个视野，在显微镜下对游动孢子囊进行计数，每处理4皿，试验重复3次。
同菌丝生长抑制试验，计算54个菌株的EC50，并进行正态分布检验。
2 结果与分析
2．1 辣椒疫霉菌的分离
从广东省广州番禺、韶关始兴、阳江阳西、湛江雷州、茂名信宜以及惠州博罗等辣椒疫霉病经常发生的地区采集的辣椒疫病样本，经分离、纯化和鉴定后，确认得到了54个辣椒疫霉菌菌株(表1)。
2．2 辣椒疫霉菌对嘧菌酯的敏感性水平测定
2．2．1 辣椒疫霉病菌菌丝生长对嘧菌酯的敏感性
对单孢分离得到的54个单孢菌株，采用菌丝生长速率法测定各菌株的EC50(表1)。
54个辣椒疫霉病菌菌株对嘧菌酯敏感性测定的结果表明，病菌群体对嘧菌酯敏感性表现没有太大差异，如EC50最高为湛江雷州的LZ9，EC50为1.950 9 μg／mL，而惠州的HZl菌株EC50最低，只有0.142 8 μg／mL，供试54个菌株的平均EC50。为0.964 9 μg／mL。
在疫霉菌对药剂的敏感性变化范围内，将EC50 等分为16个阶段，统计每个阶段菌株的个数和频率，然后以每个阶段EC50的中值为横坐标，频率为纵坐标，作出频率分布图(图1)，图中的峰代表病原菌群体对药剂的敏感性分布；同时，采用sPsS敏感性分布进行了K-S正态性检验，得Z=0.711 4，P=0.692 0，EC50表现连续性，则说明这54个菌株对嘧菌酯不同敏感性菌株的频率分布符合正态分布，辣椒疫霉自然种群对嘧菌酯没有明显的抗药性。
因此对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂而言，病菌群体基本还处于原始种群，故此试验测定得到的54个菌株对嘧菌酯的平均EC500.964 9 μg／mL，可作为辣椒疫霉菌对嘧菌酯的敏感性基线。
2．2．2 辣椒疫霉病菌游动孢子囊形成对嘧菌酯的敏感性
当某一杀菌剂使用之前，病原群体中就有极少数菌株对此杀菌剂表现抗性，只是频率很小。产生抗性的原因可能是：对单一作用位点的杀菌剂，病原菌只要发生单基因或少数寡基因的突变就可以导致病原物靶点结构的改变，而降低对专化性药剂的亲和性，某些生理生化代谢也可以发生某种变化，修饰细胞壁结构或生物膜的结构，阻止药剂到达作用靶标，或者减少对药剂的吸收，或者增加排泄，减少药剂在细胞内的积累等而表现抗药性。在测定辣椒疫霉菌游动孢子囊形成对嘧菌酯的敏感性时，发现EC50频率分布没有呈现正态分布，而是有拖尾现象，可能主要是由菌株本身具有较低的抗性的结果。因为就疫霉菌本身来说，它是易产生突变的物种。
关键词：辣椒疫霉；嘧菌酯；抗药性
中图分类号：S，182．2
辣椒疫病是由辣椒疫霉(Phytohpthora capsici)引起的一种毁灭性土传病害。在世界各地的辣椒种植区普遍发生，我国各辣椒产区疫病大量发生，严重影响了辣椒的产量和品质。辣椒疫霉除了侵染辣椒以外，还可以侵染番茄、茄子、黄瓜、甜瓜、西瓜、南瓜等，病菌侵染后潜育期短，发病快，因而辣椒疫病防治十分困难。目前，防治辣椒疫病主要用化学防治方法，由于辣椒疫霉菌极易对杀菌剂产生抗药性，化学防治的效果常常因为病菌抗药性的提高而大大降低。
在无菌操作条件下，将辣椒感病组织，切成0.5 cm见方的小块，用75％的乙醇对上述小块病组织表面消毒后，用已灭好菌的滤纸、保湿纸和硬纸依次由内到外包好，然后放在d=9 cm铺有滤纸和保湿纸的培养肌中，每皿放3块，在25℃下培养7～15 d，其中每隔3天观察1次并保持病组织块的湿润状态。选取白色霉状物的病组织块，再按照常规方法用次氯酸钠溶液灭菌1 min后，放于选择性培养基上进行培养。
按郑小波的方法，将盛有大量孢子囊的培养皿放入4℃冰箱中10～15 min后，取出置于25℃下30 min，低倍镜下可见大量游动孢子释放．用灭菌吸管吸取孢子悬浮液1～4滴(视孢子浓度而定)涂布于含青霉素、利福平、五氯硝基苯各50 μg／mL的10％V8汁水琼脂平板上，置25℃黑暗培养8～12 h。取出培养皿置于显微镜下观察；切取带有单个已萌发游动孢子的琼脂块置于选择性培养基(含青霉素、利福平、五氯硝基苯各50 μg／mL的LBA培养基(利马豆60 g加水1 000 mL，充分煮沸，4层纱布过滤去渣，滤液补足水至1 000 mL，加入琼脂20 g)平板上，在25℃黑暗中培养2～3 d，可获得纯净的单游动孢子无性系。
1．2 辣椒疫霉菌丝生长对嘧菌酯的敏感性测定
本试验所用的嘧菌酯由先正达公司赠送，为98％原药。原药先用V(甲醇)：V(丙酮)=1：3配制成浓度为100 μg／mL的母液备用。
将疫霉菌接种于LBA培养基平板上，25℃下黑暗培养5 d，用直径4 mm的打孔器在近菌落边缘1／3处打孔，制成接种菌丝圆碟。取适量的嘧菌酯母液，加入溶化后冷却到50℃左右的LBA培养基中，混匀，制成0、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 μg／mL梯度浓度的LBA平板。待培养基冷却后用接种针挑取菌碟，菌面向下接于含毒培养基中心，每皿1块。放入恒温箱中，25℃下培养5 d用十字交叉法测量菌落直径，每处理4皿，试验重复3次。
测量菌落直径，依下式计算不同浓度药剂对疫霉菌菌丝生长抑制率：
计算抑制率几率值和浓度对数值的毒力方程，毒力公式计算嘧菌酯对疫霉菌各菌株的抑制中浓度EC50及相关系数r值。数值统计计算用SAS程序进行。
对54个菌株的EC50进行正态分布检验，确定是否符合正态分布。正态分布检验用SAS程序进行。
1．3 辣椒疫霉游动孢子囊形成对嘧菌酯的敏感性测定
参照Matheron等的方法，从生长在LBA平板上的疫霉菌落边缘1／3处打直径为5 mm的菌碟4块，置于直径为9 cm的培养皿中，加入含有0、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 μg／mL嘧菌酯的无菌水5 mL，使得液面刚刚没过菌丝块，24℃下光暗交替(12 h∥12 h)培养3 d后，倒去无菌水，在菌碟上滴加少许酸性品红，10～15 s后滴加乳酸直至洗去大量品红。游动孢子囊呈现红色，在菌碟上随机挑取3个视野，在显微镜下对游动孢子囊进行计数，每处理4皿，试验重复3次。
同菌丝生长抑制试验，计算54个菌株的EC50，并进行正态分布检验。
2 结果与分析
2．1 辣椒疫霉菌的分离
从广东省广州番禺、韶关始兴、阳江阳西、湛江雷州、茂名信宜以及惠州博罗等辣椒疫霉病经常发生的地区采集的辣椒疫病样本，经分离、纯化和鉴定后，确认得到了54个辣椒疫霉菌菌株(表1)。
2．2 辣椒疫霉菌对嘧菌酯的敏感性水平测定
2．2．1 辣椒疫霉病菌菌丝生长对嘧菌酯的敏感性
对单孢分离得到的54个单孢菌株，采用菌丝生长速率法测定各菌株的EC50(表1)。
54个辣椒疫霉病菌菌株对嘧菌酯敏感性测定的结果表明，病菌群体对嘧菌酯敏感性表现没有太大差异，如EC50最高为湛江雷州的LZ9，EC50为1.950 9 μg／mL，而惠州的HZl菌株EC50最低，只有0.142 8 μg／mL，供试54个菌株的平均EC50。为0.964 9 μg／mL。
在疫霉菌对药剂的敏感性变化范围内，将EC50 等分为16个阶段，统计每个阶段菌株的个数和频率，然后以每个阶段EC50的中值为横坐标，频率为纵坐标，作出频率分布图(图1)，图中的峰代表病原菌群体对药剂的敏感性分布；同时，采用sPsS敏感性分布进行了K-S正态性检验，得Z=0.711 4，P=0.692 0，EC50表现连续性，则说明这54个菌株对嘧菌酯不同敏感性菌株的频率分布符合正态分布，辣椒疫霉自然种群对嘧菌酯没有明显的抗药性。
因此对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂而言，病菌群体基本还处于原始种群，故此试验测定得到的54个菌株对嘧菌酯的平均EC500.964 9 μg／mL，可作为辣椒疫霉菌对嘧菌酯的敏感性基线。
2．2．2 辣椒疫霉病菌游动孢子囊形成对嘧菌酯的敏感性
当某一杀菌剂使用之前，病原群体中就有极少数菌株对此杀菌剂表现抗性，只是频率很小。产生抗性的原因可能是：对单一作用位点的杀菌剂，病原菌只要发生单基因或少数寡基因的突变就可以导致病原物靶点结构的改变，而降低对专化性药剂的亲和性，某些生理生化代谢也可以发生某种变化，修饰细胞壁结构或生物膜的结构，阻止药剂到达作用靶标，或者减少对药剂的吸收，或者增加排泄，减少药剂在细胞内的积累等而表现抗药性。在测定辣椒疫霉菌游动孢子囊形成对嘧菌酯的敏感性时，发现EC50频率分布没有呈现正态分布，而是有拖尾现象，可能主要是由菌株本身具有较低的抗性的结果。因为就疫霉菌本身来说，它是易产生突变的物种。