论文部分内容阅读
摘要：探讨人白介素-12转基因马铃薯体系外源基因表达的遗传稳定性。方法：将重组质粒用农杆菌介导法转染马铃薯茎段，筛选转基因植株，通过ELISA检测hIL-12在转基因马铃薯中的表达情况。结果经ELISA检测茎和叶中hIL-12的表达量，其中2株与对照组相比有显著性差异（P<0.05），转基因马铃薯含有hIL-12的量分别为3714.0±48.8pg/g和3465.0±185.0pg/g。结论：人白介素-12转基因马铃薯体系外源基因表达的遗传稳定性强
关键词：人白细胞介素12；遗传稳定性；马铃薯
中图分类号：G633.91
人白细胞介素-12（human interleukin 12， hIL-12）是由单核细胞、巨噬细胞分泌表达的一种细胞因子，具有广泛的生物学活性，它能促进NK细胞和T细胞的增殖、活化及细胞毒作用，促进巨噬细胞的活化，并诱导多种细胞因子的产生，调节Th0细胞向Th1细胞分化增殖，增强细胞免疫功能[1-2]。本文利用基因重组技术，构建人白介素-12基因的植物表达载体，将hIL-12基因导入马铃薯，获取转基因马铃薯植株，探索人白介素-12转基因马铃薯体系外源基因表达的遗传稳定性，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要材料
质粒pCA13-hIL-12由中科院遗传发育研究所提供；pBI121由浙江大学提供；根癌农杆菌EHA105以及辅助质粒pRK2013由中国科学院植物研究所提供；菌株DH5α购于上海生工生物工程公司。hIL-12基因引物按基因库中cDNA序列设计，两端分别加上SmaⅠ和SacⅠ酶切位点，由上海生物工程公司合成。引物序列见下：①上游引物 5’-TCC CCC GGG CCA CCA TGG GTC ACC AGC A-3’，下游引物 5’-A CCG GAG CTC TTA GGA AGC ATT CAG ATA G-3’。细胞株COS-7购自中科院遗传发育研究所，马铃薯试管苗（中薯1号），由本实验室传代培养。
1.2 马铃薯体系外源基因表达体系的建立
1.2.1 马铃薯试管苗的培育
选择粗壮的试管苗，无菌下切成带一叶一节的接种于MS生长培养基上，温度25℃，光照14h/d，光强2000lx培养。
1.2.2 转化
平板上分别挑出三亲杂交转化后的根癌农杆菌EHA105单个菌落，接种在三抗LB液体培养基中28℃，过夜培养，4℃ 5000rpm离心10min，菌体重悬于MS0中，使OD600调整为0.5；无菌状态下，将培育好的马铃薯试管苗，剪下茎段在上述菌液中浸泡5min，用无菌滤纸吸干表面菌液，转入表面铺有一层滤纸的愈伤组织诱导培养基上，于28℃暗培养3d后，转到抗性愈伤组织诱导培养基上，25℃光照16h/d，光强2000lx培养，诱导抗性愈伤组织，10-15d后，伤口部位出现微小的愈伤组织，将愈伤组织连同外植体一起转移到芽分化培养基上，20-25d后分化出小芽，每两周更换一次培养基。
1.2.3 转化体的筛选
待芽分化培养基上的芽长至2-3cm高时，切下转至无激素的生根培养基上继代培养，进行生根筛选，将在抗性培养基上生根的马铃薯植株切成带有2-3个节的茎段，接种在MS高糖培养基上，暗处诱导试管苗结薯。观察组：马铃薯试管苗，剪下茎段在三亲杂交转化后的根癌农杆菌EHA105菌液中浸泡5min，用无菌滤纸吸干表面菌液。对照组：马铃薯试管苗，剪下茎段在未进行三亲杂交转化后的根癌农杆菌EHA105菌液中浸泡5min，用无菌滤纸吸干表面菌液。
1.3 遗传稳定性分析
用双抗体夹心ELISA方法检测转基因马铃薯中hIL-12蛋白表达量，按试剂盒说明书完成。
1.4 统计学处理
所有数据用SPSS（11.5版本）统计软件进行统计学分析，结果用 ±S表示，P<0.05示有显著性差异。
2 结果
51、80号马铃薯茎和叶的蛋白提取液中hIL-12的表达量分别为2228.4±29.3和2078.9±111.0pg/ml，与对照组对比差异明显（P<0.05）。具体见表1。同时经过计算，在51、80号马铃薯中，转基因马铃薯含有hIL-12的量分别为3714.0±48.8pg/g和3465.0±185.0pg/g，与对照组对比差异明显（P<0.05）。
表1：ELISA检测转基因马铃薯茎和叶中hIL-12的表达水平
组别 hIL-12表达量（pg/ml）
对照组 1083.5±103.5
51号 2228.4±29.3
80号 2078.9±111.0
F 16.323
P 0.000
3 讨论
近几年来，随着植物基因工程及生物技术的飞速发展，1992年，Mason[3]等提出了利用植物作生物反应器生产口服疫苗的设想。马铃薯这一世界性的粮食和蔬菜作物，被众多研究者认为是较理想的植物材料之一[3-4]。
用马铃薯作为生物反应器因其具有生长容易，产量大；遗传转化体系比较完善，转化周期短，可以通过无性繁殖快繁获得的基因转化植株；小鼠可以直接生食块茎，有利于动物免疫实验等特点，而倍受科学工作者的青睐。本实验室已建立了马铃薯试管苗通过茎段进行快速繁殖的方法，且有学者都用茎段作为外植体浸苗取得了成功，故选用马铃薯茎段作为浸染的外植体。实验采用农杆菌EHA105生长至对数长期的菌液冲释5～10倍，即OD600=0.5左右菌液浓度最好，浓度太稀或太浓都会使转化率降低。这是因为农杆菌的浓度首先影响其菌体在植物细胞上的附着，在一定范围内菌液浓度越大附着率越高，转化率越大。但超过了一定范围，由于菌的毒害作用或生长过快等导致植物材料的坏死，从而降低了转化率[5]。实验中发现，浸染5分钟，共培养3d最适宜。浸染及共培养时间过长，容易导致外植体受农杆菌伤害严重，再生困难，有的茎段伤口变黑渐渐褐化死亡，同时后期除菌工作也是难题；过短则农杆菌感染和DNA转移又不充分。在22株转基因植株中随机选取2株观察组转基因马铃薯，经ELISA检测茎和叶中hIL-12的表达量，其中2株与对照组相比有显著性差异，结果表明目的基因已整合到马铃薯基因组中[6]。对于阴性植株，可能是外源基因在转入植株中出现了失活与沉默，这一现象涉及到转基因重复拷贝之间的配对、基因甲基化、表达调控及插入位点由于引起的染色体高级结构的改变和外源基因随机整合等多种因素所致。
总之，人白介素-12转基因马铃薯体系外源基因表达的遗传稳定性强，不过从转基因马铃薯中大规模提取制备hIL-12及活性检测尚需在今后工作中继续研究。
参考文献：
[1] 张阳德，蔡素娜，廖允军.阳离子脂质体及其在基因转移和基因治疗中的应用[J].中国现代医学杂志，2011，11（7）：28-30
[2] 王关林 植物基因工程[M].北京：科学出版社，2011：45-47.
[3] 罗小英，侯磊，李德谋，等.大麦β1，3 葡聚糖酶基因表达载体的构建及其对马铃薯的遗传转化[J].西南农业学报，2000，13（4）：1-4.
[4] EF Sharaf，AA Farrag.Induced resistance in tomato plants by IAA against Fusarium oxysporum lycopersici.Pol J Microbiol，2004，53（2）：111-116.
[5] 程振东，卫志明，许智宏.根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植株的再生[J].植物学报，2004，36（9）：657-663.
[6] 杨美珠，潘乃燧，陈章良.高效马铃薯遗传转化体系的建立及甜蛋白基因的导入[J].植物学报，2012，34（1）：31-36.
关键词：人白细胞介素12；遗传稳定性；马铃薯
中图分类号：G633.91
人白细胞介素-12（human interleukin 12， hIL-12）是由单核细胞、巨噬细胞分泌表达的一种细胞因子，具有广泛的生物学活性，它能促进NK细胞和T细胞的增殖、活化及细胞毒作用，促进巨噬细胞的活化，并诱导多种细胞因子的产生，调节Th0细胞向Th1细胞分化增殖，增强细胞免疫功能[1-2]。本文利用基因重组技术，构建人白介素-12基因的植物表达载体，将hIL-12基因导入马铃薯，获取转基因马铃薯植株，探索人白介素-12转基因马铃薯体系外源基因表达的遗传稳定性，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要材料
质粒pCA13-hIL-12由中科院遗传发育研究所提供；pBI121由浙江大学提供；根癌农杆菌EHA105以及辅助质粒pRK2013由中国科学院植物研究所提供；菌株DH5α购于上海生工生物工程公司。hIL-12基因引物按基因库中cDNA序列设计，两端分别加上SmaⅠ和SacⅠ酶切位点，由上海生物工程公司合成。引物序列见下：①上游引物 5’-TCC CCC GGG CCA CCA TGG GTC ACC AGC A-3’，下游引物 5’-A CCG GAG CTC TTA GGA AGC ATT CAG ATA G-3’。细胞株COS-7购自中科院遗传发育研究所，马铃薯试管苗（中薯1号），由本实验室传代培养。
1.2 马铃薯体系外源基因表达体系的建立
1.2.1 马铃薯试管苗的培育
选择粗壮的试管苗，无菌下切成带一叶一节的接种于MS生长培养基上，温度25℃，光照14h/d，光强2000lx培养。
1.2.2 转化
平板上分别挑出三亲杂交转化后的根癌农杆菌EHA105单个菌落，接种在三抗LB液体培养基中28℃，过夜培养，4℃ 5000rpm离心10min，菌体重悬于MS0中，使OD600调整为0.5；无菌状态下，将培育好的马铃薯试管苗，剪下茎段在上述菌液中浸泡5min，用无菌滤纸吸干表面菌液，转入表面铺有一层滤纸的愈伤组织诱导培养基上，于28℃暗培养3d后，转到抗性愈伤组织诱导培养基上，25℃光照16h/d，光强2000lx培养，诱导抗性愈伤组织，10-15d后，伤口部位出现微小的愈伤组织，将愈伤组织连同外植体一起转移到芽分化培养基上，20-25d后分化出小芽，每两周更换一次培养基。
1.2.3 转化体的筛选
待芽分化培养基上的芽长至2-3cm高时，切下转至无激素的生根培养基上继代培养，进行生根筛选，将在抗性培养基上生根的马铃薯植株切成带有2-3个节的茎段，接种在MS高糖培养基上，暗处诱导试管苗结薯。观察组：马铃薯试管苗，剪下茎段在三亲杂交转化后的根癌农杆菌EHA105菌液中浸泡5min，用无菌滤纸吸干表面菌液。对照组：马铃薯试管苗，剪下茎段在未进行三亲杂交转化后的根癌农杆菌EHA105菌液中浸泡5min，用无菌滤纸吸干表面菌液。
1.3 遗传稳定性分析
用双抗体夹心ELISA方法检测转基因马铃薯中hIL-12蛋白表达量，按试剂盒说明书完成。
1.4 统计学处理
所有数据用SPSS（11.5版本）统计软件进行统计学分析，结果用 ±S表示，P<0.05示有显著性差异。
2 结果
51、80号马铃薯茎和叶的蛋白提取液中hIL-12的表达量分别为2228.4±29.3和2078.9±111.0pg/ml，与对照组对比差异明显（P<0.05）。具体见表1。同时经过计算，在51、80号马铃薯中，转基因马铃薯含有hIL-12的量分别为3714.0±48.8pg/g和3465.0±185.0pg/g，与对照组对比差异明显（P<0.05）。
表1：ELISA检测转基因马铃薯茎和叶中hIL-12的表达水平
组别 hIL-12表达量（pg/ml）
对照组 1083.5±103.5
51号 2228.4±29.3
80号 2078.9±111.0
F 16.323
P 0.000
3 讨论
近几年来，随着植物基因工程及生物技术的飞速发展，1992年，Mason[3]等提出了利用植物作生物反应器生产口服疫苗的设想。马铃薯这一世界性的粮食和蔬菜作物，被众多研究者认为是较理想的植物材料之一[3-4]。
用马铃薯作为生物反应器因其具有生长容易，产量大；遗传转化体系比较完善，转化周期短，可以通过无性繁殖快繁获得的基因转化植株；小鼠可以直接生食块茎，有利于动物免疫实验等特点，而倍受科学工作者的青睐。本实验室已建立了马铃薯试管苗通过茎段进行快速繁殖的方法，且有学者都用茎段作为外植体浸苗取得了成功，故选用马铃薯茎段作为浸染的外植体。实验采用农杆菌EHA105生长至对数长期的菌液冲释5～10倍，即OD600=0.5左右菌液浓度最好，浓度太稀或太浓都会使转化率降低。这是因为农杆菌的浓度首先影响其菌体在植物细胞上的附着，在一定范围内菌液浓度越大附着率越高，转化率越大。但超过了一定范围，由于菌的毒害作用或生长过快等导致植物材料的坏死，从而降低了转化率[5]。实验中发现，浸染5分钟，共培养3d最适宜。浸染及共培养时间过长，容易导致外植体受农杆菌伤害严重，再生困难，有的茎段伤口变黑渐渐褐化死亡，同时后期除菌工作也是难题；过短则农杆菌感染和DNA转移又不充分。在22株转基因植株中随机选取2株观察组转基因马铃薯，经ELISA检测茎和叶中hIL-12的表达量，其中2株与对照组相比有显著性差异，结果表明目的基因已整合到马铃薯基因组中[6]。对于阴性植株，可能是外源基因在转入植株中出现了失活与沉默，这一现象涉及到转基因重复拷贝之间的配对、基因甲基化、表达调控及插入位点由于引起的染色体高级结构的改变和外源基因随机整合等多种因素所致。
总之，人白介素-12转基因马铃薯体系外源基因表达的遗传稳定性强，不过从转基因马铃薯中大规模提取制备hIL-12及活性检测尚需在今后工作中继续研究。
参考文献：
[1] 张阳德，蔡素娜，廖允军.阳离子脂质体及其在基因转移和基因治疗中的应用[J].中国现代医学杂志，2011，11（7）：28-30
[2] 王关林 植物基因工程[M].北京：科学出版社，2011：45-47.
[3] 罗小英，侯磊，李德谋，等.大麦β1，3 葡聚糖酶基因表达载体的构建及其对马铃薯的遗传转化[J].西南农业学报，2000，13（4）：1-4.
[4] EF Sharaf，AA Farrag.Induced resistance in tomato plants by IAA against Fusarium oxysporum lycopersici.Pol J Microbiol，2004，53（2）：111-116.
[5] 程振东，卫志明，许智宏.根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植株的再生[J].植物学报，2004，36（9）：657-663.
[6] 杨美珠，潘乃燧，陈章良.高效马铃薯遗传转化体系的建立及甜蛋白基因的导入[J].植物学报，2012，34（1）：31-36.