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摘 要：目的：筛选刺五加总苷的大孔树脂纯化工艺。方法：以紫丁香苷为对照，采用分光光度法，通过刺五加总苷对5种大孔树脂的静态吸附及解析效果考察，筛选出适合纯化刺五加总苷的大孔树脂，进而通过动态吸附及解析的条件对纯化刺五加总苷的工艺进行优化。结果：D-101型大孔树脂适合纯化刺五加总苷，优化后的最佳富集工艺条件为：上样液质量浓度为0.3 g·ml-1，上样量为50 ml/10 g树脂，依次用7倍树脂体积量水及75%乙醇进行洗脱，浓缩干燥乙醇洗脱液，得刺五加总苷。刺五加总苷转移率达60%以上。结论：本方法适合刺五加总苷的富集。
关键词：刺五加 刺五加总苷 大孔吸附树脂 工艺优化
中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2013）03（b）-0226-02
刺五加为五加科植物刺五加Acnthopanax senticosus （Rupr.et Maxim.） Harms的干燥根及根茎，又名五加参、刺拐棒，具有扶正固本、补肾安宁之功效[1]。刺五加中含紫丁香苷，刺五加苷D和异秦皮啶等酚苷类物质。药理学实验表明，刺五加具有抗心肌缺血[2]，抗疲劳[3]，改善老年痴呆及帕金森氏症[4～6]等作用，其主要有效组分为刺五加总苷。本实验以刺五加总苷为考察指标，采用大孔吸附树脂法对其进行富集，确定刺五加总苷的最佳富集条件。
目前有关于应用大孔吸附树脂富集刺五加总苷的报道中，终产品有效物质含量都不足20%[7]，本研究希望对此有所改进。
1 仪器与试药
W-2102 PC型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KQ-250B型超声波震荡提取器（昆山市仪器有限公司）。
刺五加生药购自当地某药店（产地：吉林，批号：D0201），由北京药植所赵晓宏副研究员鉴定为五加科植物刺五加Acnthopanax senticosus （Rupr.et Maxim.） Harms的干燥根及根茎；紫丁香苷（纯度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-11082414），甲醇、乙醇（分析醇），RO反渗透水，D-101型，D-201型，AB-8型，ADS-7型，S-8型大孔树脂购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司。
2 方法与结果
2.1 刺五加总苷含量测定方法[8]
2.1.1 测定波长的选择
配制一定浓度的紫丁香苷对照品溶液，在190 nm～1100 nm进行全波长扫描，在265 nm处有最大吸收，因此确定265 nm为测定波长。
2.1.2 标准品溶液的配制
精密称取紫丁香苷标准品2.51 mg，用甲醇定容于50 ml容量瓶中，配制成浓度为50.2 μg·ml-1的对照品溶液，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，备用。
2.1.3 上柱样品液的配制
取刺五加生药材粗粉2 kg，加入10倍量浓度为60%的乙醇溶液，80 ℃热回流提取2次，每次1 h，合并提取液，过滤，浓缩至干，制成干膏。上样时加入不同体积的溶剂配制成浓度适宜的上柱样品液。
2.1.4 标准曲线的制备
分别精密吸取对照品溶液1 ml，1.5 ml， 2 ml，2.5 ml，3 ml，3.5 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得系列对照品溶液。以甲醇为空白，在265 nm处测定吸光度，以紫丁香苷浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线，得回归方程为Y=0.047X-0.003，r2=0.9999，结果表明紫丁香苷在5～17 μg·ml-1范围线性良好。
2.1.5 样品测定
精密秤取刺五加干膏0.13 g，用甲醇定容于25 ml容量瓶中，过滤，取滤液，以甲醇为空白，在265 nm处测定吸光度，带入回归方程，经计算提取物中刺五加总苷含量为13.0%。
2.2 不同型号大孔吸附树脂的筛选[9]
2.2.1 静态吸附性能考察
精密取5份刺五加干膏0.340 g，分别置250 ml具塞锥形瓶中，加入50 ml水使之充分溶解，顺次加入2.000 g已处理好的5种不同树脂，20 °C恒温振摇24 h，转速130 r·min-1，使之饱和吸附，将滤液浓缩至干，在265 nm处测定吸光度，按以下公式计算不同型号的大孔吸附树脂对于刺五加总苷的吸附率：吸附率%=（吸附前上柱样品液中刺五加总苷量-吸附后滤液中刺五加总苷量）/吸附前上柱样品液中刺五加总苷量×100%，平行做3次，平均吸附率分别为：D-101：91.17%； D-201：85.21%；AB-8：94.80%；ADS-7：93.98%；S-8：94.80%。
2.2.2 静态解析性能考察
吸附刺五加总苷的树脂用水洗至Molish反应为阴性，吸干树脂表面水分后，分别加入20 ml95%乙醇，20 °C恒温振摇4 h，转速130 r·min-1。过滤，将滤液浓缩至干，测定紫丁香苷相对含量，并在265 nm处测定吸光度，按以下公式计算不同型号的大孔树脂对刺五加总苷的解析率：解析率%=解析的刺五加总苷量/（吸附前上柱样品液中刺五加总苷量-吸附后流出液中刺五加总苷量）×100%，结果见表1。
由以上可知，D-201型大孔树脂对刺五加总苷的静态吸附量较小，并且解析效果不好，而其他4种型号大孔树脂对刺五加总苷的吸附量均较好。ADS-7和S-8两种型号的大孔树脂吸附刺五加总苷的能力极佳，但是很难洗脱。对于剩余两种型号的大孔树脂D-101和AB-8来讲，AB-8的吸附能力要稍好于D-101，但是解析刺五加总苷的能力却稍显逊色，解析率要低于D-101。综合考虑，选用D-101型大孔树脂分离纯化刺五加提取物。 2.3 D-101型大孔树脂动态吸附及解析条件优化
2.3.1 最佳上柱样品液浓度的考察
精密取2.540 g干膏5份，分别加入400 ml、200 ml、135 ml、100 ml、67 ml水，配制成刺五加总苷浓度为0.85 mg·ml-1，1.65 mg·ml-1，2.45 mg·ml-1，3.25 mg·ml-1，4.85 mg·ml-1的上柱样品液，分别以1 ml·min-1的流速通过装有10gD-101型大孔树脂的层析柱，进行动态吸附，结合Molish反应用水洗至糖的反应为阴性，再分别用10倍树脂体积（10 BV，下同）浓度为95%乙醇以1 ml·min-1洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩至干，测定总苷含量并计算解析率，结果见表2。
结果表明，当上柱样品液的刺五加总苷浓度为2.45 mg·ml-1时，洗脱下来的总苷含量及解析率均为最高，故采用2.45 g·ml-1为最佳上柱样品液浓度。
2.3.2 最大上样量的考察
精密配制刺五加总苷浓度为2.45 mg·ml-1上柱样品液100 ml，以1 ml·min-1的流速通过装有10 gD-101型大孔吸附树脂的层析柱，进行动态吸附，以1 BV为一个流分接取上样后的流出液，连续接取10组，浓缩至干，测定刺五加总苷含量。以每份流出液体积为横坐标，流出液中刺五加总苷含量为纵坐标，绘制泄漏曲线，结果见表3。
根据泄漏曲线可知，当上柱样品液达到5 BV时刺五加总苷开始明显泄漏。设定刺五加总苷未吸附率10%为泄漏点，据此确定最大上柱样品液的体积为50 ml，相当于最大上样量以刺五加总苷含量计为12.34 mg·g-1树脂。
2.3.3 水洗量的考察
精密配制刺五加总苷浓度为2.45 mg·ml-1的刺五加上样液50 ml，以1 ml·min-1的流速通过装有10 gD-101型大孔树脂的层析柱，进行动态吸附，然后水洗，以每1 BV为一个流分连续接取水洗流出液，用Molish反应进行检测。结果表明，水洗至7 BV时，水溶性杂质基本全部被洗出，故确定7 BV蒸馏水为洗脱终点。
2.3.4 洗脱剂浓度的考察
精密配制刺五加总苷浓度为2.45 mg·ml-1的刺五加上样液50 ml，以1 ml·min-1的流速通过装有10 gD-101型大孔树脂的层析柱，进行动态吸附，用7 BV蒸馏水水洗至糖的反应为阴性，再依次加入10 BV15%，35%，55%，75%，95%乙醇以1 ml·min-1分次洗脱，收集各段洗出液，浓缩至干，测定刺五加总苷含量，结果见表4。
结果表明，浓度为75%的乙醇可以将98%以上的刺五加总苷洗脱下来，故确定以浓度为75%的乙醇作为洗脱剂较为合适。
2.3.5 洗脱曲线的考察
精密配制刺五加总苷浓度为2.45 mg·ml-1的刺五加上样液50 ml，以1 ml·min-1的流速通过装有10 gD-101型大孔吸附树脂的层析柱，进行动态吸附，用7 BV蒸馏水水洗至糖的反应为阴性，再加入10 BV75%乙醇以1 ml·min-1进行动态洗脱，以每1 BV为一个流分，连续接取10组，收集每组的洗脱液，浓缩至干，测定刺五加总苷含量，结果见表5。
结果表明，前7BV75%乙醇可将99%的刺五加总苷解吸下来，故确定以7BV为洗脱剂用量。
2.3.6 大孔吸附树脂工艺的确定
通过上述研究确定D-101型大孔树脂富集刺五加总苷的工艺为：精密配制刺五加总苷浓度为2.45 mg·ml-1上柱样品液50 ml，以1 ml·min-1缓慢通过预处理的D-101型大孔树脂树脂柱，用7 BV蒸馏水以1 ml·min-1冲洗，弃去水洗脱液，继用7 BV75%乙醇以1 ml·min-1洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至干，即得刺五加提取物。
2.4 验证试验
分别精确配制刺五加总苷浓度为2.45 mg·ml-1的上柱样品液，按照2.3.6方法进行试验。重复3次，得刺五加总苷含量及有效成分的回收率。结果见表6。
2.5 中试实验
将本实验扩大40倍生产，所得终产品中刺五加总苷含量为24.24%，紫丁香苷相对含量为0.97%，工艺比较稳定。
3 讨论
针对本研究的大孔吸附树脂再生，作者建议先用浓度为25%～30%乙醇洗至流出液澄清，再用浓度为90%～95%乙醇洗脱，后采用5%稀HCl和5%NaoH洗脱，其间用水洗至pH值为中性，可达到很好的再生效果。
大孔树脂法成本低、易操作、效率高得特点，近年来得到广泛应用。通过此方法，本实验刺五加终产品中刺五加总苷含量可达到20%以上，且紫丁香苷相对含量为0.9%，工艺放大后较为稳定，此方法值得深入研究，为以后研究大孔吸附树脂富集其苷类有效成分打下基础。
参考文献
[1] 2010年版《中国药典》[S].一部，192-193.
[2] Liang Qiming，Yu Xiaofeng，Qu Shaochun，et al.Acanthopanax senticosides B ameliorates oxidative damage induced by hydrogen peroxide in cultured neonatal rat cardiomyocytes[J].European Journal of Pharmacology，2010，627（1-3）：209-215.
[3] Zhang Xue-Ling，Ren Feng，Huang Wei，et a.Anti-fatigue activity of extracts of stem bark from Acanthopanax senticosus[J].Molecules，2011，16：28-37.
[4] Chihiro T， Mahoko I，Bai Y J，et al.Inhibitory Effects of Eleutherococcus senticosus Extracts on Amyloid β （25-35）-Induced Neuritic Atrophy and Synaptic Loss[J].J Pharmacol Sci，2008，107：329-339.
[5] Fujikawa T，KanadaN，Shimada A，et al.Effect of Sesamin in Acanthopanax senticosus HARMS on Behavioral Dysfunction in Rotenone-Induced Parkinsonian Rats[J].Biol.Pharm.Bull，2005，28（1）：169-172.
[6] Fujikawa T， M iguchi S， Kanada N，et al.Acanthopanax senticosus Harms as a prophylactic for MPTP-induced Parkinson’s disease in rats[J].J Ethnopharmacol，2005，97（2）：375-381.
[7] 郭冷秋，张博，李延利.刺五加总苷的提取及纯化研究进展[J].2012，40（4）：127-129.
[8] 曲中原，金哲雄，高文昊，等.刺五加总苷提取工艺研究[J].哈尔滨商业大学学报，2005，21（1）：14-16.
关键词：刺五加 刺五加总苷 大孔吸附树脂 工艺优化
中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2013）03（b）-0226-02
刺五加为五加科植物刺五加Acnthopanax senticosus （Rupr.et Maxim.） Harms的干燥根及根茎，又名五加参、刺拐棒，具有扶正固本、补肾安宁之功效[1]。刺五加中含紫丁香苷，刺五加苷D和异秦皮啶等酚苷类物质。药理学实验表明，刺五加具有抗心肌缺血[2]，抗疲劳[3]，改善老年痴呆及帕金森氏症[4～6]等作用，其主要有效组分为刺五加总苷。本实验以刺五加总苷为考察指标，采用大孔吸附树脂法对其进行富集，确定刺五加总苷的最佳富集条件。
目前有关于应用大孔吸附树脂富集刺五加总苷的报道中，终产品有效物质含量都不足20%[7]，本研究希望对此有所改进。
1 仪器与试药
W-2102 PC型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KQ-250B型超声波震荡提取器（昆山市仪器有限公司）。
刺五加生药购自当地某药店（产地：吉林，批号：D0201），由北京药植所赵晓宏副研究员鉴定为五加科植物刺五加Acnthopanax senticosus （Rupr.et Maxim.） Harms的干燥根及根茎；紫丁香苷（纯度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-11082414），甲醇、乙醇（分析醇），RO反渗透水，D-101型，D-201型，AB-8型，ADS-7型，S-8型大孔树脂购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司。
2 方法与结果
2.1 刺五加总苷含量测定方法[8]
2.1.1 测定波长的选择
配制一定浓度的紫丁香苷对照品溶液，在190 nm～1100 nm进行全波长扫描，在265 nm处有最大吸收，因此确定265 nm为测定波长。
2.1.2 标准品溶液的配制
精密称取紫丁香苷标准品2.51 mg，用甲醇定容于50 ml容量瓶中，配制成浓度为50.2 μg·ml-1的对照品溶液，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，备用。
2.1.3 上柱样品液的配制
取刺五加生药材粗粉2 kg，加入10倍量浓度为60%的乙醇溶液，80 ℃热回流提取2次，每次1 h，合并提取液，过滤，浓缩至干，制成干膏。上样时加入不同体积的溶剂配制成浓度适宜的上柱样品液。
2.1.4 标准曲线的制备
分别精密吸取对照品溶液1 ml，1.5 ml， 2 ml，2.5 ml，3 ml，3.5 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得系列对照品溶液。以甲醇为空白，在265 nm处测定吸光度，以紫丁香苷浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线，得回归方程为Y=0.047X-0.003，r2=0.9999，结果表明紫丁香苷在5～17 μg·ml-1范围线性良好。
2.1.5 样品测定
精密秤取刺五加干膏0.13 g，用甲醇定容于25 ml容量瓶中，过滤，取滤液，以甲醇为空白，在265 nm处测定吸光度，带入回归方程，经计算提取物中刺五加总苷含量为13.0%。
2.2 不同型号大孔吸附树脂的筛选[9]
2.2.1 静态吸附性能考察
精密取5份刺五加干膏0.340 g，分别置250 ml具塞锥形瓶中，加入50 ml水使之充分溶解，顺次加入2.000 g已处理好的5种不同树脂，20 °C恒温振摇24 h，转速130 r·min-1，使之饱和吸附，将滤液浓缩至干，在265 nm处测定吸光度，按以下公式计算不同型号的大孔吸附树脂对于刺五加总苷的吸附率：吸附率%=（吸附前上柱样品液中刺五加总苷量-吸附后滤液中刺五加总苷量）/吸附前上柱样品液中刺五加总苷量×100%，平行做3次，平均吸附率分别为：D-101：91.17%； D-201：85.21%；AB-8：94.80%；ADS-7：93.98%；S-8：94.80%。
2.2.2 静态解析性能考察
吸附刺五加总苷的树脂用水洗至Molish反应为阴性，吸干树脂表面水分后，分别加入20 ml95%乙醇，20 °C恒温振摇4 h，转速130 r·min-1。过滤，将滤液浓缩至干，测定紫丁香苷相对含量，并在265 nm处测定吸光度，按以下公式计算不同型号的大孔树脂对刺五加总苷的解析率：解析率%=解析的刺五加总苷量/（吸附前上柱样品液中刺五加总苷量-吸附后流出液中刺五加总苷量）×100%，结果见表1。
由以上可知，D-201型大孔树脂对刺五加总苷的静态吸附量较小，并且解析效果不好，而其他4种型号大孔树脂对刺五加总苷的吸附量均较好。ADS-7和S-8两种型号的大孔树脂吸附刺五加总苷的能力极佳，但是很难洗脱。对于剩余两种型号的大孔树脂D-101和AB-8来讲，AB-8的吸附能力要稍好于D-101，但是解析刺五加总苷的能力却稍显逊色，解析率要低于D-101。综合考虑，选用D-101型大孔树脂分离纯化刺五加提取物。 2.3 D-101型大孔树脂动态吸附及解析条件优化
2.3.1 最佳上柱样品液浓度的考察
精密取2.540 g干膏5份，分别加入400 ml、200 ml、135 ml、100 ml、67 ml水，配制成刺五加总苷浓度为0.85 mg·ml-1，1.65 mg·ml-1，2.45 mg·ml-1，3.25 mg·ml-1，4.85 mg·ml-1的上柱样品液，分别以1 ml·min-1的流速通过装有10gD-101型大孔树脂的层析柱，进行动态吸附，结合Molish反应用水洗至糖的反应为阴性，再分别用10倍树脂体积（10 BV，下同）浓度为95%乙醇以1 ml·min-1洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩至干，测定总苷含量并计算解析率，结果见表2。
结果表明，当上柱样品液的刺五加总苷浓度为2.45 mg·ml-1时，洗脱下来的总苷含量及解析率均为最高，故采用2.45 g·ml-1为最佳上柱样品液浓度。
2.3.2 最大上样量的考察
精密配制刺五加总苷浓度为2.45 mg·ml-1上柱样品液100 ml，以1 ml·min-1的流速通过装有10 gD-101型大孔吸附树脂的层析柱，进行动态吸附，以1 BV为一个流分接取上样后的流出液，连续接取10组，浓缩至干，测定刺五加总苷含量。以每份流出液体积为横坐标，流出液中刺五加总苷含量为纵坐标，绘制泄漏曲线，结果见表3。
根据泄漏曲线可知，当上柱样品液达到5 BV时刺五加总苷开始明显泄漏。设定刺五加总苷未吸附率10%为泄漏点，据此确定最大上柱样品液的体积为50 ml，相当于最大上样量以刺五加总苷含量计为12.34 mg·g-1树脂。
2.3.3 水洗量的考察
精密配制刺五加总苷浓度为2.45 mg·ml-1的刺五加上样液50 ml，以1 ml·min-1的流速通过装有10 gD-101型大孔树脂的层析柱，进行动态吸附，然后水洗，以每1 BV为一个流分连续接取水洗流出液，用Molish反应进行检测。结果表明，水洗至7 BV时，水溶性杂质基本全部被洗出，故确定7 BV蒸馏水为洗脱终点。
2.3.4 洗脱剂浓度的考察
精密配制刺五加总苷浓度为2.45 mg·ml-1的刺五加上样液50 ml，以1 ml·min-1的流速通过装有10 gD-101型大孔树脂的层析柱，进行动态吸附，用7 BV蒸馏水水洗至糖的反应为阴性，再依次加入10 BV15%，35%，55%，75%，95%乙醇以1 ml·min-1分次洗脱，收集各段洗出液，浓缩至干，测定刺五加总苷含量，结果见表4。
结果表明，浓度为75%的乙醇可以将98%以上的刺五加总苷洗脱下来，故确定以浓度为75%的乙醇作为洗脱剂较为合适。
2.3.5 洗脱曲线的考察
精密配制刺五加总苷浓度为2.45 mg·ml-1的刺五加上样液50 ml，以1 ml·min-1的流速通过装有10 gD-101型大孔吸附树脂的层析柱，进行动态吸附，用7 BV蒸馏水水洗至糖的反应为阴性，再加入10 BV75%乙醇以1 ml·min-1进行动态洗脱，以每1 BV为一个流分，连续接取10组，收集每组的洗脱液，浓缩至干，测定刺五加总苷含量，结果见表5。
结果表明，前7BV75%乙醇可将99%的刺五加总苷解吸下来，故确定以7BV为洗脱剂用量。
2.3.6 大孔吸附树脂工艺的确定
通过上述研究确定D-101型大孔树脂富集刺五加总苷的工艺为：精密配制刺五加总苷浓度为2.45 mg·ml-1上柱样品液50 ml，以1 ml·min-1缓慢通过预处理的D-101型大孔树脂树脂柱，用7 BV蒸馏水以1 ml·min-1冲洗，弃去水洗脱液，继用7 BV75%乙醇以1 ml·min-1洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至干，即得刺五加提取物。
2.4 验证试验
分别精确配制刺五加总苷浓度为2.45 mg·ml-1的上柱样品液，按照2.3.6方法进行试验。重复3次，得刺五加总苷含量及有效成分的回收率。结果见表6。
2.5 中试实验
将本实验扩大40倍生产，所得终产品中刺五加总苷含量为24.24%，紫丁香苷相对含量为0.97%，工艺比较稳定。
3 讨论
针对本研究的大孔吸附树脂再生，作者建议先用浓度为25%～30%乙醇洗至流出液澄清，再用浓度为90%～95%乙醇洗脱，后采用5%稀HCl和5%NaoH洗脱，其间用水洗至pH值为中性，可达到很好的再生效果。
大孔树脂法成本低、易操作、效率高得特点，近年来得到广泛应用。通过此方法，本实验刺五加终产品中刺五加总苷含量可达到20%以上，且紫丁香苷相对含量为0.9%，工艺放大后较为稳定，此方法值得深入研究，为以后研究大孔吸附树脂富集其苷类有效成分打下基础。
参考文献
[1] 2010年版《中国药典》[S].一部，192-193.
[2] Liang Qiming，Yu Xiaofeng，Qu Shaochun，et al.Acanthopanax senticosides B ameliorates oxidative damage induced by hydrogen peroxide in cultured neonatal rat cardiomyocytes[J].European Journal of Pharmacology，2010，627（1-3）：209-215.
[3] Zhang Xue-Ling，Ren Feng，Huang Wei，et a.Anti-fatigue activity of extracts of stem bark from Acanthopanax senticosus[J].Molecules，2011，16：28-37.
[4] Chihiro T， Mahoko I，Bai Y J，et al.Inhibitory Effects of Eleutherococcus senticosus Extracts on Amyloid β （25-35）-Induced Neuritic Atrophy and Synaptic Loss[J].J Pharmacol Sci，2008，107：329-339.
[5] Fujikawa T，KanadaN，Shimada A，et al.Effect of Sesamin in Acanthopanax senticosus HARMS on Behavioral Dysfunction in Rotenone-Induced Parkinsonian Rats[J].Biol.Pharm.Bull，2005，28（1）：169-172.
[6] Fujikawa T， M iguchi S， Kanada N，et al.Acanthopanax senticosus Harms as a prophylactic for MPTP-induced Parkinson’s disease in rats[J].J Ethnopharmacol，2005，97（2）：375-381.
[7] 郭冷秋，张博，李延利.刺五加总苷的提取及纯化研究进展[J].2012，40（4）：127-129.
[8] 曲中原，金哲雄，高文昊，等.刺五加总苷提取工艺研究[J].哈尔滨商业大学学报，2005，21（1）：14-16.