CRISPR/Cas9系统是近年来快速发展的一种简单高效的基因编辑系统。在哺乳动物中，同时靶向敲除多基因的研究仍然较为匮乏。为优化哺乳动物中靶向多基因的敲除系统的构建，本研究在已有的CRISPR/Cas9载体的基础上进行升级改造，将4个U6启动子介导的小向导RNA （small guide RNA,sgRNA）表达框串联至一个载体中的形式制备了多基因位点编辑载体，分别选取家猪（Sus scrofa）的去乙酰化酶3基因（sirtuin 3, Sirt3）和围脂滴蛋白1基因（perilipin 1, Plin1）的2个sgRNA，构建了2个猪Sirt3sgRNA的基因编辑载体（S2）、2个猪Plin1 sg RNA基因编辑载体（P2）和同时包括上述4个sgRNA的基因编辑载体（S2P2），上述载体分别转染猪肾细胞PK15，以转染未装载靶点质粒的细胞为对照组（CON组），在各实验组细胞目的基因的DNA水平、RNA水平和蛋白水平检测目的基因敲除效率。结果表明，各实验组细胞目的基因DNA中均检测出突变，S2P2组和S2组中Sirt3基因突变率分别为33%和26%,S2P2组和P2组中Plin1基因突变率分别为33%和24%；对目的基因RNA水平与蛋白水平的检测结果表明，与CON组相比，所有实验组的目标基因m RNA及蛋白表达量均有所下降，差异极显著（P<0.01），其中S2组与S2P2组间Sirt3基因表达量差异不显著；P2组与S2P2组间Plin1基因表达量差异不显著。本研究通过改良的CRISPR/Cas9载体系统构建了可以同时对猪Sirt3基因和Plin1基因高效编辑的载体，有助于后续开展多基因功能的研究。