论文部分内容阅读
摘 要：为探究固定化乳酸菌对海水中不同因素的耐受性，采用涂布分离计数法测定海水中不同pH值、NaCl浓度、Pb2+浓度、葡萄糖浓度对固定化乳酸菌生长的影响。结果表明：海水pH值为6.0，德氏乳杆菌、嗜热链球菌、屎肠球菌三种乳酸菌在海水中的活菌率分别为98.0%、117.6%、111.4%;在海水中添加NaCl和醋酸铅溶液均抑制乳酸菌的生长，但屎肠球菌的耐盐性与耐重金属铅的能力均比德式乳杆菌和嗜热链球菌强;乳酸菌生长的最适葡萄糖浓度为20%，过量葡萄糖会抑制其生长。综合比较三种乳酸菌在海水中的生长耐受性，得出屎肠球菌对海水中的pH值、NaCl浓度、Pb2+浓度及葡萄糖变量的耐受性较强。
关键词：固定化乳酸菌;海水;耐受性;屎肠球菌
随着海水养殖产业不断发展，海水污染越来越严重[1]。因此，必须加强对海水污染的治理。固定化微生物技术在水处理领域已经成为污染治理的研究热点。韩斌通过比较交联法、吸附法及包埋法固定化，得出包埋法的整体性能最好，很好地保留了微生物细胞的生物活性和催化能力，且包埋的过程操作相对简单、应用灵活[2]，在包埋法中利用海藻酸钠包埋法是最经济实惠且有效的方法之一[3]。张强在海藻酸钠包埋乳酸菌及活性分析实验中得出，在4%的CaCl2浓度时，包埋率最高，活菌数最多[4]。
乳酸菌是人及动物肠道中的益生菌，因其独特的细胞结构与生物特性使其在食品等领域中得到了很好的应用。近几年有研究人员发现乳酸菌能够吸附食品、土壤及淡水中的重金属[5]，但对乳酸菌在海水中的耐受性研究极少。本课题选用三种固定化乳酸菌，探究海水对固定化乳酸菌细胞生长的影响，为研究利用固定化乳酸菌处理海水污染问题提供参考。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
供试菌株德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、屎肠球菌（Enterococcus Faecium），均购自广东环凯微生物科技有限公司。试剂：氢氧化钠、盐酸、氯化钠、乙酸铅、葡萄糖、柠檬酸三钠等为分析纯;LB培养基为化学纯。
1.2 实验方法
1.2.1 乳酸菌的固定化
按照海藻酸钠浓度为2.0%、CaCl2浓度为2.5%、菌液添加量为20 mL（菌液添加量与无菌水比值为1∶1）的条件制备三种乳酸菌固定化小球。
1.2.2 海水对固定化乳酸菌生长的影响
将固定化后的乳酸菌小球分别投入装有无菌海水的试管中，以自然海水为对照，分别将海水pH值调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0;海水中加入NaCl，使其浓度分别达到1%、2%、4%、6%、8%;海水中加入乙酸铅，使其浓度分别达到50、100、150、200、250 mg/L;海水中加入葡萄糖，使其浓度分别达到5%、10%、20%、40%、60%。每个处理各取10 mL配制的液体加入试管中，在每支试管中再分别加入0.5 g固定化后的乳酸菌小球，置转速为150 r/min ，温度为37.5℃的恒温摇床上培养24 h，收集固定化小球，用无菌水反复冲洗3～5次，再用柠檬酸三钠溶胶处理后，取液至LB固体培养基上进行涂布平板计数。
2 结果与分析
2.1 pH值对乳酸菌生长的影响
海水中不同pH值对三种乳酸菌生长的影响见表1。
由表1可知，pH在设定范围内对德氏乳杆菌的活性影响较大，不同处理组的菌落数差异明显，但对嗜热链球菌和屎肠球菌的活性影响较小，处理组间的差异不明显。三种固定化乳酸菌在pH 4.0～8.0海水中均能生长。当海水pH值为6.0时，三种乳酸菌活性均最高，其中屎肠球菌的活菌数达到5.85×1010cfu/mL。与对照相比，德氏乳杆菌、嗜热链球菌、屎肠球菌三种乳酸菌在海水中的活菌率分别为98.0%、117.6%、111.4%;当嗜热链球菌在pH 5.0～7.0及屎肠球菌在pH 5.0～8.0之间，两种乳酸菌的活性均高于对照组，说明在该pH值范围内的海水更适合于嗜热链球菌和屎肠球菌的生长，当pH值为8.0时，德氏乳杆菌与嗜热链球菌的活菌数均比对照低，而屎肠球菌的活菌数比对照要高，其活菌率为107.6%，说明屎肠球菌比其他两种乳酸菌的耐碱性要好。
2.2 NaCl浓度对三种乳酸菌生长的影響
海水中添加不同浓度的NaCl溶液对三种乳酸菌生长的影响见表2。
由表2可知，当海水中NaCl溶液浓度大于等于6%时，对三种乳酸菌的活性影响有显著性差异，三种乳酸菌的活性均随着浓度的下降而下降。德氏乳杆菌和嗜热链球菌在NaCl浓度为1%～4%时活菌率分别能达80%以上，在NaCl浓度高于6%之后，德氏乳杆菌和嗜热链球菌的生长明显受到抑制，活菌率均不到40%。随着NaCl浓度增加，屎肠球菌的活性逐渐下降，但活性下降不明显，当海水中NaCl溶液浓度为8.0%时，三种固定化乳酸菌活性均受到明显的抑制，但对屎肠球菌的抑制作用最小，其活性仍能达到87.6%，可见屎肠球菌耐盐性明显比德式乳杆菌和嗜热链球菌高。
2.3 铅离子浓度对三种乳酸菌生长的影响
海水中不同浓度的铅离子溶液对三种乳酸菌生长的影响见表3。
由表3可知，随着海水中重金属Pb2+浓度的增加，三种乳酸菌的活性不断下降。不同浓度Pb2+处理组间差异显著，当Pb2+浓度≥150mg/L时，三种乳酸菌不同处理间菌的活性差异极显著。当Pb2+浓度在50～100 mg/L之间，三种乳酸菌活菌数缓慢下降，Pb2+浓度超过100 mg/L时，三种乳酸菌的活菌数急剧下降，当Pb2+浓度为250 mg/L时，德氏乳杆菌、嗜热链球菌及屎肠球菌的活菌率分别为：1.96%、2.94%、15.24%，可见海水中的高浓度的铅离子对乳酸菌的活性影响很大，但不同乳酸菌对重金属Pb的耐受性能不一样，其中屎肠球菌的耐重金属Pb的能力较强。 2.4 葡萄糖浓度对三种乳酸菌生长的影响
三种乳酸菌在不同葡萄糖浓度的海水中的培养后活菌计数的结果如表4。
由表4可知，当葡萄糖浓度在0～40%时，德氏乳杆菌与嗜热链球菌处理间菌的活性差异不明显，但不同浓度的葡萄糖溶液处理组间对屎肠球菌活性的影响差异显著。当海水中葡萄糖浓度在0～20%时，随着葡萄糖浓度的增加，三种乳酸菌的活性也在增加，当葡萄糖浓度为20%时，乳酸菌的活菌数最大，其中德氏乳杆菌、嗜热链球菌及屎肠球菌的活菌率分别达到101.9%、114.7%及112.3%。当海水中葡萄糖浓度高于20%时，三种乳酸菌的生长均受到抑制，活菌数开始下降。
3 小结
在海水中，固定化乳酸菌最适生长的pH值为6.0;随着NaCl浓度增加，三种乳酸菌的活性逐渐下降，德氏乳杆菌和嗜热链球菌在NaCl浓度为1%～4%时活菌率分别能达80%以上，屎肠球菌耐盐性比德式乳杆菌和嗜热链球菌强，在浓度为8.0%以内其活性均能保持在80%以上;加入乙酸铅会大量抑制固定化乳酸菌生长，当浓度大于100 mg/L时，乳酸菌大量死亡;葡萄糖可以为固定化乳酸菌的生长提供能量和碳源，最适乳酸菌生长的葡萄糖浓度为20%，当葡萄糖浓度大于20%，三种乳酸菌的生长均受到抑制，其原因可能是乳酸菌在海水中能直接利用葡萄糖作为能源和碳源，促进其生长，当葡萄糖浓度过高时，易使乳酸菌细胞渗透脱水而不利于乳酸菌的生长。
参考文献：
[1]
徐希佳，包华军.海水养殖环境污染以及控制对策研究[J].农技服务，2017，34（22）：161.
[2] 韓斌.包埋法固定化微生物问题初探[J].环境科学，2010，39（02）：164-168.
[3] 徐雪芹，李小明，杨麒，等.固定化微生物技术及其在重金属废水处理中的应用[J].环境污染治理技术与设备，2006（07）：99-105.
[4] 张强，马齐，徐升运，等.海藻酸钠包埋乳酸菌及活性分析[J].陕西农业科学，2009，55（02）：23-25.
[5] 李畅，贾原博，赵晓峰，等.乳酸菌对重金属吸附作用的研究进展[J].微生物学通报，2018，45（10）：2254-2262.
Effect ofseawater on the growth of fixed lactobacillus
MA Hongmei，TANG Chaoying，ZHANG Hanhua，PI Ziyao，YU Zhonghua
（College of Fisheries Life Science ，Hainan Tropical Ocean University，Sanya 572022）
Abstract：The effects of pH value，NaCl concentration，Pb2+ concentration and glucose concentration on the growth of immobilized lactic acid bacteria were determined by coating separation counting method in order to study the tolerance of immobilized lactic acid bacteria to different factors in seawater.The results showed that the pH of seawater was 6.0，and the living bacteria rates of Lactobacillus delbrueckii，Streptococcus thermophilus and Enterococcus Faecium in seawater were 98.0%，117.6% and 111.4% respectively. The addition of NaCl and lead acetate solution could inhibit the growth of lactobacillus ，but the salt tolerance and lead tolerance of Enterococcus Faeciumwere stronger than those of Lactobacillus delbrueckii，Streptococcus thermophilus. The optimum glucose concentration for the growth of lactic acid bacteria is 20%，and excessive glucose will inhibit the growth of lactic acid bacteria probably. It was concluded that Enterococcus Faecium had strong tolerance to pH，NaCl concentration，Pb2+ concentration and glucose variables by comparing the activities three strains of lactobacillus in seawater.
Key words：immobilization of lactobacillus; seawater;tolerance; Enterococcus Faecium
（收稿日期：2020-05-26）
关键词：固定化乳酸菌;海水;耐受性;屎肠球菌
随着海水养殖产业不断发展，海水污染越来越严重[1]。因此，必须加强对海水污染的治理。固定化微生物技术在水处理领域已经成为污染治理的研究热点。韩斌通过比较交联法、吸附法及包埋法固定化，得出包埋法的整体性能最好，很好地保留了微生物细胞的生物活性和催化能力，且包埋的过程操作相对简单、应用灵活[2]，在包埋法中利用海藻酸钠包埋法是最经济实惠且有效的方法之一[3]。张强在海藻酸钠包埋乳酸菌及活性分析实验中得出，在4%的CaCl2浓度时，包埋率最高，活菌数最多[4]。
乳酸菌是人及动物肠道中的益生菌，因其独特的细胞结构与生物特性使其在食品等领域中得到了很好的应用。近几年有研究人员发现乳酸菌能够吸附食品、土壤及淡水中的重金属[5]，但对乳酸菌在海水中的耐受性研究极少。本课题选用三种固定化乳酸菌，探究海水对固定化乳酸菌细胞生长的影响，为研究利用固定化乳酸菌处理海水污染问题提供参考。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
供试菌株德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、屎肠球菌（Enterococcus Faecium），均购自广东环凯微生物科技有限公司。试剂：氢氧化钠、盐酸、氯化钠、乙酸铅、葡萄糖、柠檬酸三钠等为分析纯;LB培养基为化学纯。
1.2 实验方法
1.2.1 乳酸菌的固定化
按照海藻酸钠浓度为2.0%、CaCl2浓度为2.5%、菌液添加量为20 mL（菌液添加量与无菌水比值为1∶1）的条件制备三种乳酸菌固定化小球。
1.2.2 海水对固定化乳酸菌生长的影响
将固定化后的乳酸菌小球分别投入装有无菌海水的试管中，以自然海水为对照，分别将海水pH值调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0;海水中加入NaCl，使其浓度分别达到1%、2%、4%、6%、8%;海水中加入乙酸铅，使其浓度分别达到50、100、150、200、250 mg/L;海水中加入葡萄糖，使其浓度分别达到5%、10%、20%、40%、60%。每个处理各取10 mL配制的液体加入试管中，在每支试管中再分别加入0.5 g固定化后的乳酸菌小球，置转速为150 r/min ，温度为37.5℃的恒温摇床上培养24 h，收集固定化小球，用无菌水反复冲洗3～5次，再用柠檬酸三钠溶胶处理后，取液至LB固体培养基上进行涂布平板计数。
2 结果与分析
2.1 pH值对乳酸菌生长的影响
海水中不同pH值对三种乳酸菌生长的影响见表1。
由表1可知，pH在设定范围内对德氏乳杆菌的活性影响较大，不同处理组的菌落数差异明显，但对嗜热链球菌和屎肠球菌的活性影响较小，处理组间的差异不明显。三种固定化乳酸菌在pH 4.0～8.0海水中均能生长。当海水pH值为6.0时，三种乳酸菌活性均最高，其中屎肠球菌的活菌数达到5.85×1010cfu/mL。与对照相比，德氏乳杆菌、嗜热链球菌、屎肠球菌三种乳酸菌在海水中的活菌率分别为98.0%、117.6%、111.4%;当嗜热链球菌在pH 5.0～7.0及屎肠球菌在pH 5.0～8.0之间，两种乳酸菌的活性均高于对照组，说明在该pH值范围内的海水更适合于嗜热链球菌和屎肠球菌的生长，当pH值为8.0时，德氏乳杆菌与嗜热链球菌的活菌数均比对照低，而屎肠球菌的活菌数比对照要高，其活菌率为107.6%，说明屎肠球菌比其他两种乳酸菌的耐碱性要好。
2.2 NaCl浓度对三种乳酸菌生长的影響
海水中添加不同浓度的NaCl溶液对三种乳酸菌生长的影响见表2。
由表2可知，当海水中NaCl溶液浓度大于等于6%时，对三种乳酸菌的活性影响有显著性差异，三种乳酸菌的活性均随着浓度的下降而下降。德氏乳杆菌和嗜热链球菌在NaCl浓度为1%～4%时活菌率分别能达80%以上，在NaCl浓度高于6%之后，德氏乳杆菌和嗜热链球菌的生长明显受到抑制，活菌率均不到40%。随着NaCl浓度增加，屎肠球菌的活性逐渐下降，但活性下降不明显，当海水中NaCl溶液浓度为8.0%时，三种固定化乳酸菌活性均受到明显的抑制，但对屎肠球菌的抑制作用最小，其活性仍能达到87.6%，可见屎肠球菌耐盐性明显比德式乳杆菌和嗜热链球菌高。
2.3 铅离子浓度对三种乳酸菌生长的影响
海水中不同浓度的铅离子溶液对三种乳酸菌生长的影响见表3。
由表3可知，随着海水中重金属Pb2+浓度的增加，三种乳酸菌的活性不断下降。不同浓度Pb2+处理组间差异显著，当Pb2+浓度≥150mg/L时，三种乳酸菌不同处理间菌的活性差异极显著。当Pb2+浓度在50～100 mg/L之间，三种乳酸菌活菌数缓慢下降，Pb2+浓度超过100 mg/L时，三种乳酸菌的活菌数急剧下降，当Pb2+浓度为250 mg/L时，德氏乳杆菌、嗜热链球菌及屎肠球菌的活菌率分别为：1.96%、2.94%、15.24%，可见海水中的高浓度的铅离子对乳酸菌的活性影响很大，但不同乳酸菌对重金属Pb的耐受性能不一样，其中屎肠球菌的耐重金属Pb的能力较强。 2.4 葡萄糖浓度对三种乳酸菌生长的影响
三种乳酸菌在不同葡萄糖浓度的海水中的培养后活菌计数的结果如表4。
由表4可知，当葡萄糖浓度在0～40%时，德氏乳杆菌与嗜热链球菌处理间菌的活性差异不明显，但不同浓度的葡萄糖溶液处理组间对屎肠球菌活性的影响差异显著。当海水中葡萄糖浓度在0～20%时，随着葡萄糖浓度的增加，三种乳酸菌的活性也在增加，当葡萄糖浓度为20%时，乳酸菌的活菌数最大，其中德氏乳杆菌、嗜热链球菌及屎肠球菌的活菌率分别达到101.9%、114.7%及112.3%。当海水中葡萄糖浓度高于20%时，三种乳酸菌的生长均受到抑制，活菌数开始下降。
3 小结
在海水中，固定化乳酸菌最适生长的pH值为6.0;随着NaCl浓度增加，三种乳酸菌的活性逐渐下降，德氏乳杆菌和嗜热链球菌在NaCl浓度为1%～4%时活菌率分别能达80%以上，屎肠球菌耐盐性比德式乳杆菌和嗜热链球菌强，在浓度为8.0%以内其活性均能保持在80%以上;加入乙酸铅会大量抑制固定化乳酸菌生长，当浓度大于100 mg/L时，乳酸菌大量死亡;葡萄糖可以为固定化乳酸菌的生长提供能量和碳源，最适乳酸菌生长的葡萄糖浓度为20%，当葡萄糖浓度大于20%，三种乳酸菌的生长均受到抑制，其原因可能是乳酸菌在海水中能直接利用葡萄糖作为能源和碳源，促进其生长，当葡萄糖浓度过高时，易使乳酸菌细胞渗透脱水而不利于乳酸菌的生长。
参考文献：
[1]
徐希佳，包华军.海水养殖环境污染以及控制对策研究[J].农技服务，2017，34（22）：161.
[2] 韓斌.包埋法固定化微生物问题初探[J].环境科学，2010，39（02）：164-168.
[3] 徐雪芹，李小明，杨麒，等.固定化微生物技术及其在重金属废水处理中的应用[J].环境污染治理技术与设备，2006（07）：99-105.
[4] 张强，马齐，徐升运，等.海藻酸钠包埋乳酸菌及活性分析[J].陕西农业科学，2009，55（02）：23-25.
[5] 李畅，贾原博，赵晓峰，等.乳酸菌对重金属吸附作用的研究进展[J].微生物学通报，2018，45（10）：2254-2262.
Effect ofseawater on the growth of fixed lactobacillus
MA Hongmei，TANG Chaoying，ZHANG Hanhua，PI Ziyao，YU Zhonghua
（College of Fisheries Life Science ，Hainan Tropical Ocean University，Sanya 572022）
Abstract：The effects of pH value，NaCl concentration，Pb2+ concentration and glucose concentration on the growth of immobilized lactic acid bacteria were determined by coating separation counting method in order to study the tolerance of immobilized lactic acid bacteria to different factors in seawater.The results showed that the pH of seawater was 6.0，and the living bacteria rates of Lactobacillus delbrueckii，Streptococcus thermophilus and Enterococcus Faecium in seawater were 98.0%，117.6% and 111.4% respectively. The addition of NaCl and lead acetate solution could inhibit the growth of lactobacillus ，but the salt tolerance and lead tolerance of Enterococcus Faeciumwere stronger than those of Lactobacillus delbrueckii，Streptococcus thermophilus. The optimum glucose concentration for the growth of lactic acid bacteria is 20%，and excessive glucose will inhibit the growth of lactic acid bacteria probably. It was concluded that Enterococcus Faecium had strong tolerance to pH，NaCl concentration，Pb2+ concentration and glucose variables by comparing the activities three strains of lactobacillus in seawater.
Key words：immobilization of lactobacillus; seawater;tolerance; Enterococcus Faecium
（收稿日期：2020-05-26）