【摘 要】
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目的 优化HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)特异性定量检测方法,并观察HBV cccDNA在慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)及肝组织中的分布情况.方法 标本抽提核酸后,以不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD)进行酶切,再以跨双缺口的特异性引物进行荧光PCR定量检测HBV cccDNA;用10份HBV高滴度(10(7)拷贝/mL)血清和梯度稀释的HBV克隆质粒标准品,验证此检
【机 构】
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200003,上海,第二军医大学附属长征医院感染科,解放军第四零四医院感染科,200003,上海,第二军医大学附属长征医院感染科,200003,上海,第二军医大学附属长征医院感染科,200003,上海
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目的 优化HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)特异性定量检测方法,并观察HBV cccDNA在慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)及肝组织中的分布情况.方法 标本抽提核酸后,以不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD)进行酶切,再以跨双缺口的特异性引物进行荧光PCR定量检测HBV cccDNA;用10份HBV高滴度(10(7)拷贝/mL)血清和梯度稀释的HBV克隆质粒标准品,验证此检测方法的特异度和灵敏度;取慢性乙型肝炎患者PBMC和肝组织穿刺标本各50份,检测其总HBV DNA和cccDNA.结果 10份血清标本均无假阳性cccDNA检测结果,灵敏度可达到10(3)拷贝/mL.所有PBMC中cccDNA检测均阴性;所有肝组织中总HBV DNA和cccDNA检测均阳性,总HBV DNA含量为3.19×10(2)～6.69×10(7)拷贝/μg人基因组DNA,cccDNA含量为7.32×10(0)～6.51×10(6)拷贝/μg人基因组DNA,同一患者肝组织中总HBV DNA含量是cccDNA含量的10.7倍至9.2×10(5)倍.结论 本方法特异度和灵敏度高.PBMC不能支持HBV的复制.在慢性乙型肝炎患者的肝组织中均可检测到cccDNA,但其水平并非与细胞内总HBV DNA水平正相关。
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目的 克隆并表达发生长片段缺失的HBV核心蛋白(HBV-C)基因,并对其进行DNA序列、蛋白质结构和抗原性分析.方法 采用PCR方法从1株野生型HBV基因组中扩增得到发生长片段缺失的HBV-C基因,克隆至pUCm-T质粒,进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析;再将基因编码区克隆至原核表达载体pET-28a,构建含HBV-C基因的重组表达质粒,转化至大肠埃希菌BL21中进行诱导表达并检测其抗原性.结
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目的 探索不分型流感嗜血杆菌（NTHi）上调人类MUC5AC黏液素基因表达的细胞分子机制。方法通过反转录套式PCR及实时荧光定量PCR分析NTHi所诱导的MUC5AC mRNA的表达，免疫沉淀及Western印迹法检测NTHi对表皮生长因子受体（EGFR）及p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）的激活，采用p38MAPK或EGFR特异性抑制剂，共转染EGFR显性失活质粒，判断在转录水平对NTH
附红细胞体病(Eperythrozoonosis,附红体病)是由附红细胞体(Eperythrozoon,附红体)引起的人畜共患疾病.早在1928年,Schilling和Dingen等几乎同时在啮齿类动物中发现类球状血虫体(E.coccoides)~([1,2]),以后许多学者相继在其他动物的红细胞上发现有多形态的微生物,并命名为附红细胞体。