9α-羟基雄烯二酮(9α-OH-AD)是制备倍他米松及地塞米松等甾体类药物的重要中间产物之一,在工业应用中,常使用谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇等植物甾醇作为底物,通过分枝杆菌等菌种生物转化获得9α-OHAD。在此过程中,3-甾酮-9α-羟基化酶(KSH)是生物转化植物甾醇为9α-OH-AD的关键酶,该酶由3-甾酮-9α-羟基化酶(Ksh A)和3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶(Ksh B)两个亚基构成。因此,提高3-甾酮-9α-羟基化酶的活性对促进9α-OH-AD的合成具有极其重要的作用。为了获得高效积累9α-OH-AD产物的重组菌株,根据NCBI提供的基因序列为主,相关设计引物软件Prime 5和DNAMAN等辅助工具设计引物Ksh A和Ksh B,PCR扩增,经过EcoR I、Nde I和EcoR I、Hind III分别双酶切Ksh A和Ksh B,同时与载体p NIT进行连接,获得了含有Ksh A基因和Ksh B基因的重组质粒p NIT-Ksh A-Ksh B,最后再将构建好的质粒电转化入分枝杆菌中,根据最小抑菌浓度卡那霉素抗性平板上筛选得到1株阳性转化子M-ks H。发酵催化积累9α-OH-AD的实验结果表明,当底物植物甾醇投料为10 g/L时,M-ks H积累9α-OH-AD产量相比较出发菌株提高了0.486 g/L,重组菌的转化率提高了50.78%。研究结果可为提高甾体类药物9-OH-AD生产效率提供一定的基础。