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为了提高现有纳豆激酶产量,促进其工业化生产与应用,本文从不同产地的鲜纳豆中分离出枯草芽孢杆菌,先后通过菌落形态初筛与酪蛋白平板复筛,选出水解圈与菌落比值较大的菌株,测定其发酵液中纳豆激酶酶活,选定一株酶活相对较高的菌株X3.通过系统16S rDNA测序鉴定和系统发育树对比,确定X3菌株为枯草芽孢杆菌.在单因素试验的基础上,设计响应面试验,优化纳豆激酶摇瓶液态发酵条件,确定了X3菌株液态发酵的最佳条件为:温度34℃,初始pH6.5,接种量2％,装瓶量20％,发酵时间30 h.在该条件下,发酵生产的纳豆激酶酶活为393.095 U/mL,且与购买的纳豆激酶相比具有更高的酶活.本试验为后续工业化生产奠定了一定基础.