目的采用全自动二维液相色谱（2D-LC-UV）法快速测定甲氨蝶呤的血药浓度。方法采用10%三氟乙酸去蛋白剂对样本进行前处理后取上清液直接进样,待测物在一维柱Aston SC2(C18,4.6 mm×25 mm,5 μm)上初步分离,通过中间柱Aston SN（苯基柱,4.6 mm×10 mm,5 μm）截取保留,最后转移到二维色谱柱Aston SX1（氰基柱,4.6 mm×75 mm,5 μm）上进一步分离、测定。一维流动相为甲醇-乙腈-10 mmol·L-1磷酸铵水溶液=1∶1∶10（V/V/V）,流速0.6 mL·min-1;二维流动相为水（含1.0 mmol·L-1磷酸氢二铵水溶液,磷酸调pH至7.40）-水（含1.0 mmol·L-1磷酸氢二铵水溶液,磷酸调pH至3.00）-甲醇-乙腈（16∶60∶10∶14）的混合体系,流速1.0 mL·min-1,柱温40℃;紫外检测波长304 nm。使用本方法监测2019年10月—2020年12月期间使用甲氨蝶呤治疗的48份样本的甲氨蝶呤血药浓度。结果甲氨蝶呤可在10 min内完整出峰且无杂质干扰,在0.05～12.8 μmol·L-1与峰面积线性关系良好（r=0.9997）,方法学考察均符合要求。检测的48份甲氨蝶呤血药浓度样本中72.9%（35/48）的样本在标准曲线范围内,10.4%（5/48）的样本因使用剂量低未检出,另有16.7%（8/48）的样本使用大剂量甲氨蝶呤后血药浓度超出正常值上限。结论本方法操作简单,灵敏度、专属性高,稳定性好,能够满足甲氨蝶呤用药后药物浓度监测及解救的需要。