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摘 要：本实验采用固定化酶催化技术合成头孢羟氨苄。头孢羟氨苄合成最佳条件为：磷酸缓冲液pH为6.5，温度为25摄氏度，酶的用量为1.5%，母核浓度为1.0%，母核与侧链HPGME比例为1：3。
关键词：酶；合成；头孢羟氨苄
头孢羟氨苄英文别名为Cefadroxil Anhydrous；（6R，7R）-7-{[（2R）-2-amino-2-（4-hydroxyphenyl）acetyl]amino}-3-methyl-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid。孢羟氨苄为第一代口服头孢菌素，对产青霉素酶和不产青霉素酶的金葡菌，凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、A组溶血性链球菌等大部分菌株具良好抗菌作用[1-4]。头孢羟氨苄口服吸收良好，受食物的影响小。固定化酶是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶在水中溶性凝胶或半透膜的微囊体从而导致流动性降低[5-8]。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。固定化酶有许多优点，尤其是稳定性和可重复使用性使其在许多领域得到广泛应用[9-12]。本实验采用固定化酶催化技术合成头孢羟氨苄。
1 主要试剂及仪器
1.1 试剂：硫酸（ 河南东科化工产品销售有限公司）、异丙醇（ 珠海市河洲精细化工有限公司）、二氯甲烷（河南东科化工产品销售有限公司）、三乙胺（深圳市富迪隆化工有限公司）、乙醇（ 东莞市盛龙化工有限公司）、盐酸（ 东莞市盛龙化工有限公司）、丙酮（ 赣州金富精细化工科技有限公司）、四氢呋喃（赣州金富精细化工科技有限公司）、氢氧化钠（沈阳市派尔精细化工制品厂）。
1.2 仪器：SCQ-K001空气超声波清洗器（上海声彦超声仪器有限公司）；IKA RV10 控制型 V 旋转蒸（广州仪科实验室技术有限公司）；PHS-3C型酸度计（金坛市顺华仪器有限公司）；Esquire 3000型LC-MS质谱仪；FA1204B电子分析天平（上海精科天美贸易有限公司）；M24×1.5型磁力搅拌器（威海景达化工机械有限公司）；精密显微熔点测定仪（上海精科物理光学仪器厂）；Vertex Sti P5000高效液相色谱仪（上海禾工科学仪器有限公司）；XYF-H 帕恩特超低有机物型超纯水机（北京湘顺源科技有限公司）；Bruker AV.400型核磁共振仪；Waters XBridge C18液相色谱柱（150*4.6mm，5un）（上海楚定分析仪器有限公司）；Chemvak无油真空泵（北京桑翌实验仪器研究所）；UV4501双光束紫外可见分光光度计（天津港东科技发展股份有限公司）；HI98103型便携式酸度计（北京宝云兴业科贸有限公司）。
1.3 色谱柱：奥泰公司 C18 色谱柱（284 mm×4.6mm，5μm）。
1.4 对照品：头孢氨苄 购自中国药品生物制品检定所。
2 分析方法
依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下：流动相：醋酸缓冲液溶液（用醋酸调pH4.0）-乙腈（93：7）为流动相，检测波长：230nm，流速：1.0m·min-1。柱温：30℃。理论板数按头孢氨苄计算应不得低于2000。
3 实验
3.1 pH对头孢羟氨苄合成的影响
在青霉素酰化酶催化合成头孢羟氨苄过程中，pH值是非常重要参数之一。本实验分别采用磷酸缓冲液pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0进行实验。磷酸缓冲液pH为5.5时头孢羟氨苄收率为33.5%；磷酸缓冲液pH为6.0时头孢羟氨苄收率为52.5%；磷酸缓冲液pH为6.5时头孢羟氨苄收率为61.3%；磷酸缓冲液pH为7.0时头孢羟氨苄收率为55.1%.实验结果表明磷酸缓冲液pH为6.5时头孢羟氨苄收率最高。
3.2 温度对头孢羟氨苄合成的影响
温度是非常重要参数之一。磷酸缓冲液pH为7.0，分别为20摄氏度、25摄氏度、30摄氏度、35摄氏度进行实验。温度为20摄氏度时头孢羟氨苄收率为52.1%；温度为25摄氏度时头孢羟氨苄收率为65.5%；温度为30摄氏度时头孢羟氨苄收率为53.1%；温度为35摄氏度时头孢羟氨苄收率为43.6%.实验结果表明温度为25摄氏度时头孢羟氨苄收率最高。
3.3 酶量对头孢羟氨苄合成的影响
青霉素酰化酶用量对催化合成头孢羟氨苄至关重要。磷酸缓冲液pH为6.5，温度为25摄氏度，分别采用酶的用量为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%进行实验。酶的用量为0.5%时头孢羟氨苄收率为59.3%；酶的用量为1.0%时头孢羟氨苄收率为61.3%；酶的用量为1.5%时头孢羟氨苄收率为67.6%；酶的用量为2.0%时头孢羟氨苄收率为67.5%；酶的用量为2.5%时头孢羟氨苄收率为65.2%；酶的用量为3.0%时头孢羟氨苄收率为66.3%；酶的用量为3.5%时头孢羟氨苄收率为66.5%。实验结果表明酶的用量为1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%时收率变化不大，所以选择酶的用量为1.5%。
3.4 母核浓度对头孢羟氨苄合成的影响
母核浓度是决定合成头孢羟氨苄浓度的重要因素。磷酸缓冲液pH为6.5，温度为25摄氏度，酶的用量为1.5%，分别考察母核浓度1.0%、2.0%、3.0%、4.0%进行实验。母核浓度为1.0%时头孢羟氨苄收率为76.3%；母核浓度为2.0%时头孢羟氨苄收率为66.3%；母核浓度为3.0%时头孢羟氨苄收率为61.1%；母核浓度为4.0%时头孢羟氨苄收率为53.1%。实验结果表明母核浓度为1.0%时头孢羟氨苄收率最高。
3.5 母核与酰基侧链比对头孢羟氨苄合成的影响
母核与酰基侧链比也是影响合成反应的一个重要因素。磷酸缓冲液pH为6.5，温度为25摄氏度，酶的用量为1.5%，母核浓度为1.0%，分别采用母核与侧链HPGME比例分别为1：1，1：2，1：3和1：4进行实验。母核与侧链HPGME比例为1：1时头孢羟氨苄收率为43.6%；母核与侧链HPGME比例为1：1时头孢羟氨苄收率为43.6%；母核与侧链HPGME比例为1：2时头孢羟氨苄收率为56.3%；母核与侧链HPGME比例为1：3时头孢羟氨苄收率为68.3%；母核与侧链HPGME比例为1：4时头孢羟氨苄收率为71.2%。实验结果表明母核与侧链HPGME比例为1：4时收率最高，但从成本考虑选择母核与侧链HPGME比例为1：3。
4 结果
头孢羟氨苄合成最佳条件为：磷酸缓冲液pH为6.5，温度为25摄氏度，酶的用量为1.5%，母核浓度为1.0%，母核与侧链HPGME比例为1：3。
参考文献
[1]陈希杨，王普，应国清，等.酶法合成头孢菌素类抗生素的研究进展[J].浙江工业大学学报，2002，30（1）：53 58.
[2]郭敏亮，姜涌明，马中良.壳聚糖固定化AS1.398中性蛋白酶稳定性的研究[J].微生物学通报，1996（01）.
[3]锁爱莉，姚煜，李恩孝.疏水-亲水型硅胶固定化葡萄糖氧化酶的研究[J].西安交通大学学报（医学版），2004（03）
[4]张莉，陶剑虹.半合成青霉素市场评析[J].药学进展，1998，22（1）：58-64.
[5]朱玲，安哲.酶传感器中GOD酶固定化方法条件的选择[J].哈尔滨医科大学学报，2002（04）.
[6] 陈海光，成坚.反胶束技术及其应用[J].仲恺农业技术学院学报，2000（04）.
[7]张致平.内酰胺类抗生素研究的进展[J].中国抗生素杂志，2000，25（3），233-239.
[8]肖正华，张惠静，张梦军，管潇.壳聚糖在酶固定化中的應用[J].西南国防医药，2005（03）.
[9]李丽霞，俞耀庭，鲁格.酶稳定剂和还原剂对固定化葡萄糖氧化酶稳定性的影响[J].生物工程学报，1987（03）.
[10]吴辉煌，吴宝璋，周绍民.生物功能电极（Ⅴ）──葡萄糖氧化酶在环糊精聚合物中的固定化[J].高等学校化学学报，1994（07）.
[11]郭勇.酶工程研究进展与发展前景[J].华南理工大学学报（自然科学版），2002（11）.
[12]刘振梅，杨谦，吴健，邓红涛，徐志康.聚丙烯微孔膜表面的仿生修饰与酶固定化[J].自然科学进展，2005（10）.
关键词：酶；合成；头孢羟氨苄
头孢羟氨苄英文别名为Cefadroxil Anhydrous；（6R，7R）-7-{[（2R）-2-amino-2-（4-hydroxyphenyl）acetyl]amino}-3-methyl-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid。孢羟氨苄为第一代口服头孢菌素，对产青霉素酶和不产青霉素酶的金葡菌，凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、A组溶血性链球菌等大部分菌株具良好抗菌作用[1-4]。头孢羟氨苄口服吸收良好，受食物的影响小。固定化酶是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶在水中溶性凝胶或半透膜的微囊体从而导致流动性降低[5-8]。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。固定化酶有许多优点，尤其是稳定性和可重复使用性使其在许多领域得到广泛应用[9-12]。本实验采用固定化酶催化技术合成头孢羟氨苄。
1 主要试剂及仪器
1.1 试剂：硫酸（ 河南东科化工产品销售有限公司）、异丙醇（ 珠海市河洲精细化工有限公司）、二氯甲烷（河南东科化工产品销售有限公司）、三乙胺（深圳市富迪隆化工有限公司）、乙醇（ 东莞市盛龙化工有限公司）、盐酸（ 东莞市盛龙化工有限公司）、丙酮（ 赣州金富精细化工科技有限公司）、四氢呋喃（赣州金富精细化工科技有限公司）、氢氧化钠（沈阳市派尔精细化工制品厂）。
1.2 仪器：SCQ-K001空气超声波清洗器（上海声彦超声仪器有限公司）；IKA RV10 控制型 V 旋转蒸（广州仪科实验室技术有限公司）；PHS-3C型酸度计（金坛市顺华仪器有限公司）；Esquire 3000型LC-MS质谱仪；FA1204B电子分析天平（上海精科天美贸易有限公司）；M24×1.5型磁力搅拌器（威海景达化工机械有限公司）；精密显微熔点测定仪（上海精科物理光学仪器厂）；Vertex Sti P5000高效液相色谱仪（上海禾工科学仪器有限公司）；XYF-H 帕恩特超低有机物型超纯水机（北京湘顺源科技有限公司）；Bruker AV.400型核磁共振仪；Waters XBridge C18液相色谱柱（150*4.6mm，5un）（上海楚定分析仪器有限公司）；Chemvak无油真空泵（北京桑翌实验仪器研究所）；UV4501双光束紫外可见分光光度计（天津港东科技发展股份有限公司）；HI98103型便携式酸度计（北京宝云兴业科贸有限公司）。
1.3 色谱柱：奥泰公司 C18 色谱柱（284 mm×4.6mm，5μm）。
1.4 对照品：头孢氨苄 购自中国药品生物制品检定所。
2 分析方法
依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下：流动相：醋酸缓冲液溶液（用醋酸调pH4.0）-乙腈（93：7）为流动相，检测波长：230nm，流速：1.0m·min-1。柱温：30℃。理论板数按头孢氨苄计算应不得低于2000。
3 实验
3.1 pH对头孢羟氨苄合成的影响
在青霉素酰化酶催化合成头孢羟氨苄过程中，pH值是非常重要参数之一。本实验分别采用磷酸缓冲液pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0进行实验。磷酸缓冲液pH为5.5时头孢羟氨苄收率为33.5%；磷酸缓冲液pH为6.0时头孢羟氨苄收率为52.5%；磷酸缓冲液pH为6.5时头孢羟氨苄收率为61.3%；磷酸缓冲液pH为7.0时头孢羟氨苄收率为55.1%.实验结果表明磷酸缓冲液pH为6.5时头孢羟氨苄收率最高。
3.2 温度对头孢羟氨苄合成的影响
温度是非常重要参数之一。磷酸缓冲液pH为7.0，分别为20摄氏度、25摄氏度、30摄氏度、35摄氏度进行实验。温度为20摄氏度时头孢羟氨苄收率为52.1%；温度为25摄氏度时头孢羟氨苄收率为65.5%；温度为30摄氏度时头孢羟氨苄收率为53.1%；温度为35摄氏度时头孢羟氨苄收率为43.6%.实验结果表明温度为25摄氏度时头孢羟氨苄收率最高。
3.3 酶量对头孢羟氨苄合成的影响
青霉素酰化酶用量对催化合成头孢羟氨苄至关重要。磷酸缓冲液pH为6.5，温度为25摄氏度，分别采用酶的用量为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%进行实验。酶的用量为0.5%时头孢羟氨苄收率为59.3%；酶的用量为1.0%时头孢羟氨苄收率为61.3%；酶的用量为1.5%时头孢羟氨苄收率为67.6%；酶的用量为2.0%时头孢羟氨苄收率为67.5%；酶的用量为2.5%时头孢羟氨苄收率为65.2%；酶的用量为3.0%时头孢羟氨苄收率为66.3%；酶的用量为3.5%时头孢羟氨苄收率为66.5%。实验结果表明酶的用量为1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%时收率变化不大，所以选择酶的用量为1.5%。
3.4 母核浓度对头孢羟氨苄合成的影响
母核浓度是决定合成头孢羟氨苄浓度的重要因素。磷酸缓冲液pH为6.5，温度为25摄氏度，酶的用量为1.5%，分别考察母核浓度1.0%、2.0%、3.0%、4.0%进行实验。母核浓度为1.0%时头孢羟氨苄收率为76.3%；母核浓度为2.0%时头孢羟氨苄收率为66.3%；母核浓度为3.0%时头孢羟氨苄收率为61.1%；母核浓度为4.0%时头孢羟氨苄收率为53.1%。实验结果表明母核浓度为1.0%时头孢羟氨苄收率最高。
3.5 母核与酰基侧链比对头孢羟氨苄合成的影响
母核与酰基侧链比也是影响合成反应的一个重要因素。磷酸缓冲液pH为6.5，温度为25摄氏度，酶的用量为1.5%，母核浓度为1.0%，分别采用母核与侧链HPGME比例分别为1：1，1：2，1：3和1：4进行实验。母核与侧链HPGME比例为1：1时头孢羟氨苄收率为43.6%；母核与侧链HPGME比例为1：1时头孢羟氨苄收率为43.6%；母核与侧链HPGME比例为1：2时头孢羟氨苄收率为56.3%；母核与侧链HPGME比例为1：3时头孢羟氨苄收率为68.3%；母核与侧链HPGME比例为1：4时头孢羟氨苄收率为71.2%。实验结果表明母核与侧链HPGME比例为1：4时收率最高，但从成本考虑选择母核与侧链HPGME比例为1：3。
4 结果
头孢羟氨苄合成最佳条件为：磷酸缓冲液pH为6.5，温度为25摄氏度，酶的用量为1.5%，母核浓度为1.0%，母核与侧链HPGME比例为1：3。
参考文献
[1]陈希杨，王普，应国清，等.酶法合成头孢菌素类抗生素的研究进展[J].浙江工业大学学报，2002，30（1）：53 58.
[2]郭敏亮，姜涌明，马中良.壳聚糖固定化AS1.398中性蛋白酶稳定性的研究[J].微生物学通报，1996（01）.
[3]锁爱莉，姚煜，李恩孝.疏水-亲水型硅胶固定化葡萄糖氧化酶的研究[J].西安交通大学学报（医学版），2004（03）
[4]张莉，陶剑虹.半合成青霉素市场评析[J].药学进展，1998，22（1）：58-64.
[5]朱玲，安哲.酶传感器中GOD酶固定化方法条件的选择[J].哈尔滨医科大学学报，2002（04）.
[6] 陈海光，成坚.反胶束技术及其应用[J].仲恺农业技术学院学报，2000（04）.
[7]张致平.内酰胺类抗生素研究的进展[J].中国抗生素杂志，2000，25（3），233-239.
[8]肖正华，张惠静，张梦军，管潇.壳聚糖在酶固定化中的應用[J].西南国防医药，2005（03）.
[9]李丽霞，俞耀庭，鲁格.酶稳定剂和还原剂对固定化葡萄糖氧化酶稳定性的影响[J].生物工程学报，1987（03）.
[10]吴辉煌，吴宝璋，周绍民.生物功能电极（Ⅴ）──葡萄糖氧化酶在环糊精聚合物中的固定化[J].高等学校化学学报，1994（07）.
[11]郭勇.酶工程研究进展与发展前景[J].华南理工大学学报（自然科学版），2002（11）.
[12]刘振梅，杨谦，吴健，邓红涛，徐志康.聚丙烯微孔膜表面的仿生修饰与酶固定化[J].自然科学进展，2005（10）.