【摘 要】
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目的初步探讨瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)对体外培养的缺氧早期小鼠心肌细胞自噬的影响及机制。方法取120只1～2 d龄雌雄不拘C57BL/6小鼠，分离心脏培养原代心肌细胞，并进行如下实验，分组方法均按照随机数字表法。(1)将细胞分为常氧组及缺氧3、6、9 h组，每组1孔。常氧组细胞行常规培养(下同)，缺氧3、6、9 h组细胞采用不含胎牛血清的DMEM无糖培养基于体积分数1%氧气、5%二氧化
【机 构】
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陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院全军烧伤研究所，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 400038,陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院全军烧伤研究所，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，
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目的初步探讨瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)对体外培养的缺氧早期小鼠心肌细胞自噬的影响及机制。
方法取120只1～2 d龄雌雄不拘C57BL/6小鼠，分离心脏培养原代心肌细胞，并进行如下实验，分组方法均按照随机数字表法。(1)将细胞分为常氧组及缺氧3、6、9 h组，每组1孔。常氧组细胞行常规培养(下同)，缺氧3、6、9 h组细胞采用不含胎牛血清的DMEM无糖培养基于体积分数1%氧气、5%二氧化碳、94%氮气的低氧条件下分别培养3、6、9 h。蛋白质印迹法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin-1及TRPV1的蛋白表达。(2)将细胞分为常氧组和缺氧组，每组2张盖玻片，其中缺氧组细胞同前缺氧处理6 h。免疫荧光法检测TRPV1的阳性表达。(3)将细胞分为4组，每组1孔。单纯缺氧组细胞同前行缺氧处理6 h；缺氧＋0.1 μmol/L辣椒素组、缺氧＋1.0 μmol/L辣椒素组、缺氧＋10.0 μmol/L辣椒素组细胞分别加入0.1、1.0、10.0 μmol/L辣椒素处理30 min后，行缺氧处理6 h。蛋白质印迹法检测LC3、Beclin-1及TRPV1的蛋白表达。(4)将细胞分为5组，每组5孔。缺氧组细胞同前缺氧处理6 h；缺氧＋氯喹组、缺氧＋辣椒素组、缺氧＋辣椒素＋氯喹组细胞分别加入50 μmol/L氯喹、10.0 μmol/L辣椒素、50 μmol/L氯喹＋10.0 μmol/L辣椒素处理30 min后缺氧处理6 h。细胞计数试剂盒8法检测细胞活力。(5)将细胞分为单纯缺氧组及缺氧＋10.0 μmol/L辣椒素组，每组1孔，前者细胞同前缺氧处理6 h；后者细胞加入10.0 μmol/L辣椒素处理30 min后，行缺氧处理6 h。蛋白质印迹法检测溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1)、LAMP-2的蛋白表达。各实验重复3次或5次。对数据行单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正。
结果(1)与常氧组比较，缺氧3、6、9 h组心肌细胞中LC3、Beclin-1、TRPV1蛋白表达明显增高(t3 h＝4.891、5.890、4.928，t6 h＝9.790、6.750、10.590，t9 h＝6.948、6.764、5.049，P<0.05或P<0.01)；缺氧6 h组3种蛋白表达最高，分别为1.08±0.05、1.12±0.10、0.953±0.071。(2)缺氧组TRPV1在心肌细胞膜和胞内密度明显增加，呈团块状分布，表达明显强于常氧组。(3)与单纯缺氧组比较，缺氧＋0.1 μmol/L辣椒素组心肌细胞中Beclin-1蛋白表达明显增高(t＝10.488，P<0.01)，LC3和TRPV1蛋白表达虽增高但差异无统计学意义(t＝4.372、3.026，P>0.05)；缺氧＋1.0 μmol/L辣椒素组、缺氧＋10.0 μmol/L辣椒素组心肌细胞中LC3和TRPV1、Beclin-1蛋白表达均明显增高(t＝15.505、5.773、13.430，20.915、8.054、16.384，P<0.05或P<0.01)，其中缺氧＋10.0 μmol/L辣椒素组3种蛋白表达均达峰值，分别为2.33±0.09、1.34±0.07、1.246±0.053。(4)与常氧组(0.585±0.045)比较，缺氧组心肌细胞活力明显下降(0.471±0.037，t＝4.365，P<0.05)；与缺氧组比较，缺氧＋氯喹组心肌细胞活力进一步明显下降(0.350±0.023，t＝6.216，P<0.01)，缺氧＋辣椒素组心肌细胞活力则明显升高(0.564±0.047，t＝3.489，P<0.05)；与缺氧＋氯喹组比较，缺氧＋辣椒素＋氯喹组心肌细胞活力无明显变化(0.364±0.050，t＝0.545，P>0.05)。(5)与单纯缺氧组(0.99±0.04、0.54±0.04)比较，缺氧＋10.0 μmol/L辣椒素组心肌细胞中LAMP-1和LAMP-2蛋白表达明显增加(1.49±0.06、0.81±0.05，t＝12.550、7.442，P<0.01)。
结论TRPV1通过自噬-溶酶体途径进一步促进缺氧早期小鼠心肌细胞自噬相关蛋白的表达，增强自噬活性，改善自噬流，减轻早期缺氧心肌细胞的损伤。
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