【摘 要】
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目的 建立端粒酶活性的多重荧光定量PCR（Taqman探针）检测方法 ,并进行验证。方法 针对端粒酶催化亚基（telomerase reverse transcriptase,TERT）的CDS序列设计特异性逆转录引物、2对定量引物及探针。优化反应体系中的逆转录引物（特异性逆转录引物和随机引物）及定量引物（2对定量引物探针单独及混合使用）,与内参基因GAPDH引物和探针在单管中进行多重荧光定量PC
【基金项目】
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国家自然科学基金（31672550）； 国家重点研发计划（2018YFA081101）；
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目的 建立端粒酶活性的多重荧光定量PCR（Taqman探针）检测方法 ,并进行验证。方法 针对端粒酶催化亚基（telomerase reverse transcriptase,TERT）的CDS序列设计特异性逆转录引物、2对定量引物及探针。优化反应体系中的逆转录引物（特异性逆转录引物和随机引物）及定量引物（2对定量引物探针单独及混合使用）,与内参基因GAPDH引物和探针在单管中进行多重荧光定量PCR反应。用293T及MRC-5细胞分别制备端粒酶阳性标准品及阴性标准品,并验证方法 的稳定性及精密性。采用建立的方法 检测19份正常间充质细胞样本和32份乳腺癌细胞样本的端粒酶活性。结果 最佳反应体系为:以特异性逆转录引物合成的cDNA为模板,将TERT基因2对定量引物和探针混合后与内参基因GAPDH引物和探针在单管中进行多重荧光定量PCR反应。优化后大幅提高了体系的灵敏性,TERT荧光信号量（2Rn）增强了3倍。阳性标准品TERT基因扩增曲线正常,且与GAPDH基因之间的2Ct保持稳定;阴性标准品GAPDH基因扩增曲线正常,无TERT基因扩增曲线。反复冻融;3及5次阳性标准品的TERT与GAPDH基因之间的ΔCt与未冻融过的阳性标准品比较,差异较小;组内和组间精密性CV均＜1%。19份正常间充质细胞样本端粒酶活性均为阴性,32份乳腺癌细胞样本端粒酶活性均为阳性,两者TERT基因的Ct值差异有统计学意义（t=4.236,P ＜0.001）。结论 建立的端粒酶活性多重荧光定量PCR（Taqman探针）检测方法 具有良好的稳定性及精密性,有望应用于肿瘤早期诊断和基因治疗。
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