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中圖分类号 R965 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2021）19-2347-07
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.19.07
摘 要 目的：研究姜黄素固体脂质纳米粒（Cur-SLN）对心肾综合征模型大鼠心、肾、肺功能及细胞自噬相关因子表达的影响。方法：将大鼠分为假手术组、模型组、雷帕霉素组（阳性对照，2 mg/kg）和Cur-SLN低、高剂量组（5、10 mg/kg），除模型组13只大鼠外（其中3只用于判断是否造模成功），其余各组10只。除假手术组外，其余各组大鼠均采用腹主动脉缩窄合并肾急性缺血再灌注损伤法复制心肾综合征模型。造模成功后，各给药组大鼠均尾静脉注射相应药物，假手术组和模型组大鼠注射等体积生理盐水，每天1次，连续4周。末次注射24 h后，检测大鼠血清中血管紧张素转换酶（ACE）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）及精氨酸加压素（AVP）的含量;观察大鼠心脏、肾、肺组织的病理学形态;检测大鼠心脏、肾、肺组织中LC3、Beclin-1蛋白的分布情况和表达水平。结果：与假手术组比较，模型组大鼠血清中ACE、FT3含量，心脏、肾指数以及心脏、肾、肺组织中LC3（肾组织中除外）、Beclin-1蛋白的表达水平均显著升高（P<0.01），AVP含量和肺指数均显著降低（P<0.01）;心脏非梗死区心肌细胞明显肥大、心肌纤维排列紊乱，肾非梗死区肾小管结构紊乱、呈囊性扩张，肺泡可见明显炎性细胞浸润;心脏、肾、肺组织中LC3、Beclin-1蛋白的阳性表达均增多，主要分布于心肌细胞的细胞质、远端肾小管上皮细胞和肺泡巨噬细胞、上皮细胞中。与模型组比较，Cur-SLN各剂量组大鼠上述指标大部分显著逆转;心脏、肾、肺组织的病理改变程度均减轻，炎性细胞浸润减少，且LC3、Beclin-1蛋白的阳性表达均减少，主要分布于心肌细胞细胞质、近端肾小管上皮细胞中，少数分布于远端肾小管上皮细胞和肺泡巨噬细胞、上皮细胞中。结论：Cur-SLN 可改善心肾综合征模型大鼠的心、肾、肺功能，其作用机制可能与调控LC3、Beclin-1蛋白在心脏、肾、肺组织的分布或表达有关。
关键词 姜黄素;固体脂质纳米粒;心肾综合征;自噬
Effects of Curcumin Solid Lipid Nanoparticles on Cardiac， Renal and Pulmonary Functions and the Expression of Autophagy Related Factors in Cardiorenal Syndrome Model Rats
LI Xu，HAO Di，LIU Weiwei，WANG Zi，SHI Pengcheng，LI Nan（Tianjin Institute for Medical and Pharmaceutical Science， Tianjin 300020， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of Curcumin solid lipid nanoparticels （Cur-SLN） on cardiac， renal and pulmonary functions， the expression of autophagy related factors in cardiorenal syndrome model rats. METHODS： The rats were divided into sham operation group， model group， rapamycin group （positive control， 2 mg/kg）， Cur-SLN low-dose and high-dose groups （5， 10 mg/kg）， except for 13 rats in the model group（3 of which are used to judge whether modeling is successful）， 10 rats in the other groups. Except for sham operation group， cardiorenal syndrome of other groups were induced by abdominal aortic coarctation combined with acute renal ischemia-reperfusion injury. After successful modeling， rats in each administration group were injected with corresponding drugs through caudal vein， and rats in sham operation group and model group were injected with equal volume normal saline ，once a day for 4 weeks. Twenty-four hours after the last administration， the contents of angiotensin converting enzyme （ACE）， free triiodothyronine （FT3） and arginine vasopressin （AVP） in rat serum were detected. The pathological morphology of rat heart， kidney and lung were observed. The distribution and expression of LC3 and Beclin-1 protein in rat heart， kidney and lung were detected. RESULTS： Compared with sham operation group， the contents of ACE and FT3 in serum， the indexes of heart and kidney， the expression of LC3 （except in renal tissue） and Beclin-1 protein in heart， kidney and lung were significantly increased （P<0.01）， and the contents of AVP and lung index were decreased significantly （P<0.01）; myocardial cells in the non-infarcted area of the heart were obviously hypertrophic， the arrangement of myocardial fibers was disordered; the structure of renal tubules in the non-infarcted area of the kidney was disordered; and there was cystic expansion and obvious inflammatory cell infiltration in the alveoli; positive expression of LC3 and Beclin-1 protein in heart， kidney and lung increased， mainly distributed in the cytoplasm of cardiomyocytes， distal renal tubular epithelial cells， alveolar macrophages and epithelial cells. Compared with model group， the above indexes of rats in each dose group of Cur-SLN were mostly significantly reversed; the pathological changes of heart， kidney and lung tissues were reduced， the infiltration of inflammatory cells was reduced; and the positive expression of LC3 and Beclin-1 protein were reduced， which were mainly distributed in the cytoplasm of cardiomyocytes and proximal renal tubular epithelial cells， and a few in distal renal tubular epithelial cells， alveolar macrophages and epithelial cells. CONCLUSIONS： Cur-SLN can improve the heart， kidney and lung functions of rats with cardiorenal syndrome， and its mechanism may be related to regulating the distribution or expression of LC3 and Beclin-1 protein in heart， kidney and lung. KEYWORDS Curcumin; Solid lipid nanoparticles; Cardiorenal syndrome; Autophagy
心肾综合征是指心脏和肾中的一个器官发生慢性或急性功能损伤，从而导致另一个器官出现慢性或急性功能障碍的一种临床综合征[1]。随着研究的深入，研究者发现，心肾综合征患者往往存在肺水肿症状，使得肺扩张程度降低，从而加重病情[2]。细胞自噬是一种分解代谢过程，涉及细胞内长寿命蛋白和受损细胞器的降解，其在肿瘤、心力衰竭、衰老相关性疾病、神经退行性疾病以及传染病等多种生命进程中发挥着重要作用[3]。本课题组在前期的研究中发现，有效调控心肾综合征模型大鼠心肌组织中自噬相关蛋白LC3的表达，对改善大鼠心肾功能、延缓细胞衰竭具有一定的积极作用[4]。由此推测，以自噬为靶向治疗策略，可能成为预防和治疗心肾综合征的重要新途径之一。
姜黄素（curcumin，Cur）是从姜黄根茎中提取出来的一种多酚类化合物，是中药姜黄的主要活性成分[5]。研究发现，Cur具有调节组织细胞凋亡和自噬功能的作用[6]，因此笔者推测其可能具有治療心肾综合征的作用，但其是否可通过影响心脏、肾、肺组织中细胞自噬相关因子的表达来治疗心肾综合征，尚不明确。
由于Cur难溶于水，血药浓度和生物利用度较低，很难在病灶区维持有效浓度，使其在临床应用中受到了一定的限制[5，7]。固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）是一种针对低生物利用度的活性成分的理想递药系统[8]。基于此，本课题组在前期研究中采用微乳法制备了姜黄素固体脂质纳米粒（Cur-SLN）[9]。现以Cur-SLN为干预物，探讨其对心肾综合征模型大鼠心、肾、肺功能和细胞自噬相关因子表达的影响，以期为Cur-SLN的作用机制研究和临床应用提供理论基础。
1 材料
1.1 主要仪器
本文所用主要仪器包括LC-2010型高效液相色谱（HPLC）仪（日本Shimadzu公司），XW-80A型涡旋混合仪（上海医科大学仪器厂），HWS-24型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司），XW-80A型定时恒温磁力搅拌器（上海沪西分析仪器厂有限公司），PHS-3C型精密pH计（上海精密科学仪器有限公司），Nikon Ci-L型显微镜（日本Nikon公司），HMIAS-2000型高清晰度数码显微图像分析系统（北京利金阳科技发展有限公司），PL203型精密电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]，EG1150H型生物组织包埋机、RM 21351型切片机（德国Leica公司），B071型光学显微镜（日本Olympus公司），DNM-9602型酶标仪（北京普朗有限公司），BR162123型电泳仪（美国Bio-Rad公司），LAS-500型凝胶成像系统（美国GE公司）。
1.2 主要药品与试剂
Cur原料药（批号TZSW200317-1，纯度99.0%）购自西安通泽生物科技有限公司;雷帕霉素（批号H12J10J79598，纯度99%）购自上海源叶生物科技有限公司;大鼠血管紧张素转换酶（ACE）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒、精氨酸加压素（AVP）ELISA试剂盒、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）ELISA试剂盒、兔抗大鼠LC3单克隆抗体（批号分别为9J2811、9J2811、9J2811、6N26）均购自美国SAB公司;细胞裂解液试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号分别为P00138、P0010）均购自上海碧云天生物技术有限公司;生物素标记的山羊抗兔免疫球蛋白G抗体（二抗）、兔抗大鼠β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（批号分别为201806、BM0627）购自武汉博士德生物有限公司;超敏ECL化学发光试剂盒（批号17122220）购自沈阳万类生物科技有限公司;兔抗大鼠Beclin-1单克隆抗体（批号3507223001）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司;兔SP试剂盒（兔链霉卵白素-生物素法检测系统）（批号K197713D）购自北京中杉金桥生物技术有限公司;其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为娃哈哈纯净水。
1.3 实验动物
本研究所用实验动物为SPF级SD大鼠，雄性，体质量220～240 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号为SCXK（京）2016-0006。所有动物均正常摄食、饮水。
2 方法
2.1 Cur-SLN的制备
采用微乳法进行制备[9]。称取Cur原料药50 mg、硬脂酸0.5 g，于65 ℃条件下熔化;再加入4倍量（V/V）相同温度的聚山梨酯80乙醇溶液和适量水，涡旋1 min，制成水包油（O/W）型微乳。在电磁搅拌（1 000 r/min）下，将上述微乳以5 s/滴的速度滴入2 ℃的水中;当微乳全部加入后，继续搅拌15 min，即得Cur-SLN混悬液（以Cur计，质量浓度为0.77 mg/mL，载药量为7.72%）。
2.2 分组、造模与给药
将大鼠适应性喂养7 d后，分为假手术组、模型组、雷帕霉素组（阳性对照，2 mg/kg，剂量参考文献[10]设置）和Cur-SLN低、高剂量组（5、10 mg/kg，剂量参考文献[11-12]设置），除模型组13只外，其余各组均10只。除假手术组外，其余各组大鼠均采用腹主动脉缩窄合并肾急性缺血再灌注损伤法复制心肾综合征模型。具体造模方法如下：大鼠腹腔注射45 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，行腹部正中切开，沿腹白线进入腹腔，暴露分离左、右侧肾蒂，阻断结扎30 min后，解除阻断，恢复血流，造成肾急性缺血再灌注损伤;随后，暴露分离后腹膜，沿游离腹主动脉长轴置一折弯的7号针头，以3-0的丝线绕腹主动脉后与7号针头一起结扎，随后立即抽出针头，使腹主动脉残留直径为0.7 mm的残腔，造成腹主动脉狭窄[13]。假手术组只同法分离肌肉、血管，但不阻断。术后，在各组大鼠腹腔内滴入青霉素以预防感染，然后分层关闭腹腔。造模8周后，取3只模型组大鼠，剖解其心肾组织进行观察，当出现心肌肥厚、肾肿大时，则表明造模成功。造模成功后，各给药组大鼠均尾静脉注射相应药物（注射体积为1 mL/kg），假手术组和模型组大鼠同法注射等体积生理盐水，每天1次，连续4周。 2.3 大鼠血清中ACE、FT3、AVP的含量测定
末次给药24 h后，将大鼠麻醉，于腹主动脉取血。血样静置30 min 后，以3 500 r/min离心10 min，取上层血清，按ELISA试剂盒说明书相关方法操作，采用酶标仪于450 nm波长下测定血清中ACE、FT3、AVP的含量。
2.4 大鼠心脏、肾、肺指数的测定
取血完成后，处死大鼠，取其心脏、肾、肺组织;分离心肌组织后，称定心脏湿质量、肾湿质量、肺湿质量，然后计算各脏器指数（脏器指数=脏器湿质量/体质量×100%）。
2.5 大鼠心脏、肾、肺组织病理学形态观察
取“2.4”项下各组大鼠心脏、肾、肺组织适量，置于4%多聚甲醛溶液中固定，经70%、80%、90%、95%乙醇和无水乙醇梯度脱水，再以二甲苯透明替换、浸蜡、包埋、切片（厚度约5 μm）。各组大鼠均取2张相应脏器切片进行苏木精-伊红（HE）染色（另外3张切片后续进行免疫组化实验），然后于光学显微镜下观察其心脏、肾、肺组织的病理学形态。
2.6 大鼠心脏、肾、肺组织中细胞自噬相关因子的表达分布检测
采用免疫组化法进行检测。取“2.5”项下各组大鼠另外3张相应脏器切片，经脱蜡并复水后，以磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗5 min×3次，滴加3%H2O2，室温静置10 min;以PBS冲洗5 min×3次，置于枸橼酸钠溶液中煮沸10 min以热修复抗原;冷却后以PBS冲洗5 min×3次，滴加山羊血清进行封闭，室温静置 20 min;甩去多余液体，滴加 LC3、Beclin-1一抗（稀释度均为1 ∶ 500）50 ?L，室温静置1 h;以PBS冲洗5 min×3次，滴加二抗，室温孵育15 min;以PBS缓冲液冲洗3 min×3次，滴加辣根酶标记的链霉卵白素-生物素免疫复合物适量，室温孵育15 min;以PBS缓冲液冲洗3 min×3次，加入DAB显色液适量，室温孵育8 min;采用光学显微镜进行观察，并拍照。当切片中呈现明显的棕黄色颗粒则为阳性表达，呈现不着色或浅色则为阴性表达。
2.7 大鼠心脏、肾、肺组织中细胞自噬相关因子的表达水平检测
采用Western blot法进行检测。取“2.4”项下各组大鼠心脏、肾、肺组织适量，经剪碎、裂解后，以12 000 r/min离心5 min;取上清液，以BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。蛋白经变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE），然后转膜 70 min，以 5%牛血清白蛋白溶液室温封闭 2 h;以 TBST洗膜 5 min×3 次，加入LC3、Beclin-1、β-actin一抗（稀释度均为1 ∶ 500），4 ℃孵育过夜;以TBST洗膜5 min×3次，加入二抗（稀释度为1 ∶ 2 000），室温孵育1 h;以TBST洗膜5 min×3次，经ECL试剂显色后，置于凝胶成像系统中曝光成像。采用Image J 1.8.0软件对蛋白条带的灰度值进行分析，以 LC3、Beclin-1分别与内参β-actin灰度值的比值表示相应蛋白的表达水平。
2.8 统计学方法
采用SPSS 21.0 对数据进行统計分析，数据以x±s表示。多组间比较，若数据符合正态分布且方差齐性，则采用单因素方差分析;若方差不齐，则采用Kruskal- Wallis H检验。组间两两比较采用LSD检验。检验水准α=0.05。
3 结果
3.1 大鼠血清中ACE、FT3、AVP含量的测定结果
与假手术组比较，模型组大鼠血清中ACE、FT3含量均显著升高（P<0.01），AVP含量显著降低（P<0.01）。与模型组比较，雷帕霉素组和Cur-SLN各剂量组大鼠血清中ACE、FT3含量均显著降低（P<0.05或P<0.01），AVP含量（雷帕霉素组除外）均显著升高（P<0.05）。结果见表1。
3.2 大鼠心脏、肾、肺指数的测定结果
与假手术组比较，模型组大鼠心脏指数、肾指数均显著升高（P<0.01），肺指数显著降低（P<0.01）。与模型组比较，雷帕霉素组和Cur-SLN各剂量组大鼠心脏指数、肾指数均显著降低（P<0.01），肺指数（Cur-SLN高剂量组除外）均显著升高（P<0.05或P<0.01）。结果见表2。
3.3 大鼠心脏、肾、肺组织病理学形态观察结果
假手术组大鼠心肌细胞排列正常、间质均一;肾小管结构完整，肾小球形态正常，无扩张萎缩现象;肺泡形态大小正常，无充血及炎性细胞浸润。模型组大鼠心非梗死区心肌细胞明显肥大，心肌纤维排列紊乱，细胞间质可见局灶性纤维化及炎性细胞浸润;肾非梗死区肾小管结构紊乱、呈囊性扩张、上皮萎缩，肾小球增大、结构模糊;肺泡可见明显炎性细胞浸润。雷帕霉素组和Cur-SLN各剂量组大鼠心脏、肾、肺组织的病理改变程度均较模型组减轻，炎性细胞浸润减少。结果见图1。
3.4 大鼠心脏、肾、肺组织中细胞自噬相关因子的表达分布检测结果
在大鼠心脏组织中，假手术组LC3、Beclin1蛋白的阳性表达较低，少数分布于心肌细胞的细胞质中;模型组上述蛋白的阳性表达相较于假手术组增多，主要分布于心肌细胞的细胞质中;各给药组上述蛋白的阳性表达相较于模型组减少，主要分布于心肌细胞的细胞质中。在大鼠肾组织中，假手术组上述蛋白的阳性表达较少，主要分布于肾小管和肾小球细胞中;模型组上述蛋白的阳性表达相较于假手术组增多，主要分布于远端肾小管上皮细胞中;各给药组上述蛋白的阳性表达相较于模型组减少，主要分布于近端肾小管上皮细胞中，少数分布于远端肾小管上皮细胞中。在大鼠肺组织中，假手术组上述蛋白的阳性表达较少，主要分布于上皮细胞;模型组上述蛋白的阳性表达相较于假手术组增多，主要分布于肺泡巨噬细胞和上皮细胞中;各给药组上述蛋白阳性表达相较于模型组减少，少数分布于肺泡巨噬细胞和上皮细胞中。结果见图2。 3.5 大鼠心脏、肾、肺组织中细胞自噬相关因子的表达水平检测结果
与假手术组比较，模型组大鼠心脏、肾、肺组织中LC3（肾组织中除外）、Beclin-1蛋白的表达水平均显著升高（P<0.01）。与模型组比较，雷帕霉素组和Cur-SLN各剂量组大鼠心、肾、肺组织中LC3（肾组织中除外）、Beclin-1（Cur-SLN低剂量组肾组织中除外）蛋白表达水平均显著降低（P<0.05或P<0.01）。结果见图3、表3。
4 讨论
心肾综合征是临床常见的心肾交集或复合型疾病，因其发病率高、病死率高、治疗费用昂贵，已成为全球公共健康的重要问题[14]。心肾纤维化是心肾综合征疾病进展到终末期的重要途径和主要病理改变基础[13]。相关研究发现，姜黄素具有调节组织细胞凋亡和自噬功能的作用，还可减轻血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化和肾间质纤维化[15]，但其是否能通过调控细胞自噬来治疗心肾综合征，尚不明确。因此，本研究在制备Cur-SLN的基础上，初步探讨其对心肾综合征模型大鼠心、肾、肺功能及细胞自噬相关因子表达的影响。
有研究提示，FT3水平升高可以间接激活肾素- ACE-醛固酮系统，加重水钠潴留的状态，进一步影响心肌肥大的病理程度，使得肺氧浓度降低、动脉血管收缩、AVP含量降低，进而导致病情加重[16-18]。本研究结果显示，经Cur-SLN干预后，心肾综合征模型大鼠血清中ACE、FT3含量和心脏指数、肾指数均显著降低，AVP含量和肺指数均显著升高，心脏、肾、肺组织病理改变程度均较模型组减轻、炎性细胞浸润减少，表明Cur-SLN能有效改善心肾综合征模型大鼠的心肌肥大、肾功能以及肺组织损伤。
Beclin-1的表达与自噬体数目相关，其表达水平越高，则细胞内自噬体的数目就越多[19]。研究表明， Beclin-1在抑制肿瘤和预防心血管疾病、退行性疾病等方面均具有重要作用[20-21]。LC3是哺乳动物自噬相关基因8（Atg8）的同源物，LC3靶向定位于自噬体膜，参与自噬体的形成[22]。本研究结果显示，经Cur-SLN干预后，大鼠心脏、肾、肺组织中LC3、Beclin-1的阳性表达均较模型组减少，主要分布于心肌细胞细胞质中、近端肾小管上皮细胞中，少数分布于远端肾小管上皮細胞和肺泡巨噬细胞、上皮细胞中。进一步研究显示，经Cur-SLN干预后，模型大鼠心脏、肾、肺组织中LC3（肾组织中除外）、Beclin-1（Cur-SLN低剂量组肾组织中除外）蛋白表达水平均显著降低，表明Cur-SLN可通过调控细胞自噬相关因子表达水平，改善模型大鼠的心肌肥大、肾功能以及肺组织损伤。
综上所述，Cur-SLN 可改善心肾综合征模型大鼠的心、肾、肺功能，其作用机制可能与调控LC3、Beclin-1蛋白在心脏、肾、肺组织中的分布或表达有关。
参考文献
[ 1 ] CLEMENTI A，VIRZ? G M，BATTAGLIA G G，et al. Neurohormonal，endocrine，and immune dysregulation and inflammation in cardiorenal syndrome[J]. Cardiorenal Med，2019，9（5）：265-273.
[ 2 ] 刘高仁，李鲜.温阳利水汤对急性心力衰竭合并1型心肾综合征患者心肾功能保护效应[J].陕西中医，2019，40（4）：462-465.
[ 3 ] 李宜醒，姚伟静，易聪.细胞自噬研究进展[J].中国细胞生物学学报，2019，41（2）：192-201.
[ 4 ] 李旭，王梓，郝迪，等.参附强心丸对心肾综合征模型大鼠心肌细胞中LC3b、Bax表达的影响[J].中国药房，2016，27（19）：2602-2605.
[ 5 ] HASSANZADEH S，READ M I，Bland A R，et al. Curcumin：an inflammasome silencer[J]. Pharmacol Res，2020，159：104921.
[ 6 ] YAO Q，KE Z，GUO S，et al. Curcumin protects against dia- betic cardiomyopathy by promoting autophagy and alle- viating apoptosis[J]. J Mol Cell Cardiol，2018，124：26-34.
[ 7 ] MEHTA P，BOTHIRAJA C，MAHADIK K，et al. Phytoconstituent based dry powder inhalers as biomedicine for the management of pulmonary diseases[J]. Biomed Pharmacother，2018，108：828-837.
[ 8 ] MU H，HOLM R. Solid lipid nanocarriers in drug deli- very：characterisation and design[J]. Expert Opin Drug Deliv，2018，15（8）：771-785.
[ 9 ] 李楠，李旭，刘伟伟，等.姜黄素固体脂质纳米粒干粉吸入剂的体外释药、体内急性毒性及对哮喘模型小鼠炎症反应的影响[J].中国药房，2019，30（3）：332-338.
[10] 谢阳，张淑江，刘梦兰，等.雷帕霉素保护实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脊髓神经元的作用途径[J].中国组织工程研究，2021，25（5）：695-700.
[11] 吴鹏波，宋琪，俞媛洁，等.姜黄素激活自噬干预非酒精性脂肪肝病模型大鼠氧化应激及炎症反应[J].中国组织工程研究，2020，24（11）：1720-1725. [12] 宋莉平，王宇.姜黄素药理作用及机制研究进展[J].中国医药导报，2020，17（20）：29-34.
[13] 吴英智，杭丽玮，傅强，等.新型心肾综合征大鼠动物模型建立与评价[J].中华高血压杂志，2018，26（5）：435-442.
[14] DI LULLO L，BELLASI A，RUSSO D，et al. Cardiorenal acute kidney injury：epidemiology，presentation，causes，pathophysiology and treatment[J]. Int J Cardiol，2017，227：143-150.
[15] 范沐霞，赵塔娜，王丽敏，等.姜黄素抗纤维化研究进展[J].中医学报，2019，34（11）：2343-2348.
[16] 郑甲林，张新金，郭涛，等.甲亢源性心房颤动与肾素-血管紧张素系统相关发病机制的研究[J].现代生物医学进展，2021，21（2）：228-232.
[17] 黄钰.甲状腺激素与肾脏病理生理在肾脏疾病中的作用[J].临床内科杂志，2021，38（2）：139-141.
[18] 杜晓敏，翟磊.血液超滤对心肾综合征病人心肺功能及相关指标的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2019，17（11）：1744-1747.
[19] 孙大伟，索艳荣，冯丽莎，等.基于自噬基因Beclin-1与LC3探讨丹参素对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌ATP5G1的影响[J].中华中医药杂志，2019，34（6）：2421-2425.
[20] YUAN B，SUN M，BAO C，et al. Dynamic expression of autophagy-related factors in autoimmune encephalomyelitis and exploration of curcumin therapy[J]. J Neuroimmunol，2019，337：577067.
[21] DENG Q，LIANG L，LIU Q，et al. Autophagy is a major mechanism for the dual effects of curcumin on renal cell carcinoma cells[J]. Eur J Pharmacol，2018，826：24-30.
[22] 郜然然，周慧，吳也可，等.中医药通过mTOR途径调节细胞凋亡与自噬的研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2019，25（4）：218-224.
（收稿日期：2021-04-02 修回日期：2021-08-09）
（编辑：唐晓莲）
基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.81903565）;天津市自然科学基金资助项目（No.18JCQNJC13500）;天津市卫生健康委员会科技项目（No.KJ20082）
助理研究员，硕士。研究方向：药理学。电话：022-27236137。E-mail：187391856@qq.com
通信作者：助理研究员。研究方向：药剂学。E-mail：llittlsnows@126.com
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.19.07
摘 要 目的：研究姜黄素固体脂质纳米粒（Cur-SLN）对心肾综合征模型大鼠心、肾、肺功能及细胞自噬相关因子表达的影响。方法：将大鼠分为假手术组、模型组、雷帕霉素组（阳性对照，2 mg/kg）和Cur-SLN低、高剂量组（5、10 mg/kg），除模型组13只大鼠外（其中3只用于判断是否造模成功），其余各组10只。除假手术组外，其余各组大鼠均采用腹主动脉缩窄合并肾急性缺血再灌注损伤法复制心肾综合征模型。造模成功后，各给药组大鼠均尾静脉注射相应药物，假手术组和模型组大鼠注射等体积生理盐水，每天1次，连续4周。末次注射24 h后，检测大鼠血清中血管紧张素转换酶（ACE）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）及精氨酸加压素（AVP）的含量;观察大鼠心脏、肾、肺组织的病理学形态;检测大鼠心脏、肾、肺组织中LC3、Beclin-1蛋白的分布情况和表达水平。结果：与假手术组比较，模型组大鼠血清中ACE、FT3含量，心脏、肾指数以及心脏、肾、肺组织中LC3（肾组织中除外）、Beclin-1蛋白的表达水平均显著升高（P<0.01），AVP含量和肺指数均显著降低（P<0.01）;心脏非梗死区心肌细胞明显肥大、心肌纤维排列紊乱，肾非梗死区肾小管结构紊乱、呈囊性扩张，肺泡可见明显炎性细胞浸润;心脏、肾、肺组织中LC3、Beclin-1蛋白的阳性表达均增多，主要分布于心肌细胞的细胞质、远端肾小管上皮细胞和肺泡巨噬细胞、上皮细胞中。与模型组比较，Cur-SLN各剂量组大鼠上述指标大部分显著逆转;心脏、肾、肺组织的病理改变程度均减轻，炎性细胞浸润减少，且LC3、Beclin-1蛋白的阳性表达均减少，主要分布于心肌细胞细胞质、近端肾小管上皮细胞中，少数分布于远端肾小管上皮细胞和肺泡巨噬细胞、上皮细胞中。结论：Cur-SLN 可改善心肾综合征模型大鼠的心、肾、肺功能，其作用机制可能与调控LC3、Beclin-1蛋白在心脏、肾、肺组织的分布或表达有关。
关键词 姜黄素;固体脂质纳米粒;心肾综合征;自噬
Effects of Curcumin Solid Lipid Nanoparticles on Cardiac， Renal and Pulmonary Functions and the Expression of Autophagy Related Factors in Cardiorenal Syndrome Model Rats
LI Xu，HAO Di，LIU Weiwei，WANG Zi，SHI Pengcheng，LI Nan（Tianjin Institute for Medical and Pharmaceutical Science， Tianjin 300020， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of Curcumin solid lipid nanoparticels （Cur-SLN） on cardiac， renal and pulmonary functions， the expression of autophagy related factors in cardiorenal syndrome model rats. METHODS： The rats were divided into sham operation group， model group， rapamycin group （positive control， 2 mg/kg）， Cur-SLN low-dose and high-dose groups （5， 10 mg/kg）， except for 13 rats in the model group（3 of which are used to judge whether modeling is successful）， 10 rats in the other groups. Except for sham operation group， cardiorenal syndrome of other groups were induced by abdominal aortic coarctation combined with acute renal ischemia-reperfusion injury. After successful modeling， rats in each administration group were injected with corresponding drugs through caudal vein， and rats in sham operation group and model group were injected with equal volume normal saline ，once a day for 4 weeks. Twenty-four hours after the last administration， the contents of angiotensin converting enzyme （ACE）， free triiodothyronine （FT3） and arginine vasopressin （AVP） in rat serum were detected. The pathological morphology of rat heart， kidney and lung were observed. The distribution and expression of LC3 and Beclin-1 protein in rat heart， kidney and lung were detected. RESULTS： Compared with sham operation group， the contents of ACE and FT3 in serum， the indexes of heart and kidney， the expression of LC3 （except in renal tissue） and Beclin-1 protein in heart， kidney and lung were significantly increased （P<0.01）， and the contents of AVP and lung index were decreased significantly （P<0.01）; myocardial cells in the non-infarcted area of the heart were obviously hypertrophic， the arrangement of myocardial fibers was disordered; the structure of renal tubules in the non-infarcted area of the kidney was disordered; and there was cystic expansion and obvious inflammatory cell infiltration in the alveoli; positive expression of LC3 and Beclin-1 protein in heart， kidney and lung increased， mainly distributed in the cytoplasm of cardiomyocytes， distal renal tubular epithelial cells， alveolar macrophages and epithelial cells. Compared with model group， the above indexes of rats in each dose group of Cur-SLN were mostly significantly reversed; the pathological changes of heart， kidney and lung tissues were reduced， the infiltration of inflammatory cells was reduced; and the positive expression of LC3 and Beclin-1 protein were reduced， which were mainly distributed in the cytoplasm of cardiomyocytes and proximal renal tubular epithelial cells， and a few in distal renal tubular epithelial cells， alveolar macrophages and epithelial cells. CONCLUSIONS： Cur-SLN can improve the heart， kidney and lung functions of rats with cardiorenal syndrome， and its mechanism may be related to regulating the distribution or expression of LC3 and Beclin-1 protein in heart， kidney and lung. KEYWORDS Curcumin; Solid lipid nanoparticles; Cardiorenal syndrome; Autophagy
心肾综合征是指心脏和肾中的一个器官发生慢性或急性功能损伤，从而导致另一个器官出现慢性或急性功能障碍的一种临床综合征[1]。随着研究的深入，研究者发现，心肾综合征患者往往存在肺水肿症状，使得肺扩张程度降低，从而加重病情[2]。细胞自噬是一种分解代谢过程，涉及细胞内长寿命蛋白和受损细胞器的降解，其在肿瘤、心力衰竭、衰老相关性疾病、神经退行性疾病以及传染病等多种生命进程中发挥着重要作用[3]。本课题组在前期的研究中发现，有效调控心肾综合征模型大鼠心肌组织中自噬相关蛋白LC3的表达，对改善大鼠心肾功能、延缓细胞衰竭具有一定的积极作用[4]。由此推测，以自噬为靶向治疗策略，可能成为预防和治疗心肾综合征的重要新途径之一。
姜黄素（curcumin，Cur）是从姜黄根茎中提取出来的一种多酚类化合物，是中药姜黄的主要活性成分[5]。研究发现，Cur具有调节组织细胞凋亡和自噬功能的作用[6]，因此笔者推测其可能具有治療心肾综合征的作用，但其是否可通过影响心脏、肾、肺组织中细胞自噬相关因子的表达来治疗心肾综合征，尚不明确。
由于Cur难溶于水，血药浓度和生物利用度较低，很难在病灶区维持有效浓度，使其在临床应用中受到了一定的限制[5，7]。固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）是一种针对低生物利用度的活性成分的理想递药系统[8]。基于此，本课题组在前期研究中采用微乳法制备了姜黄素固体脂质纳米粒（Cur-SLN）[9]。现以Cur-SLN为干预物，探讨其对心肾综合征模型大鼠心、肾、肺功能和细胞自噬相关因子表达的影响，以期为Cur-SLN的作用机制研究和临床应用提供理论基础。
1 材料
1.1 主要仪器
本文所用主要仪器包括LC-2010型高效液相色谱（HPLC）仪（日本Shimadzu公司），XW-80A型涡旋混合仪（上海医科大学仪器厂），HWS-24型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司），XW-80A型定时恒温磁力搅拌器（上海沪西分析仪器厂有限公司），PHS-3C型精密pH计（上海精密科学仪器有限公司），Nikon Ci-L型显微镜（日本Nikon公司），HMIAS-2000型高清晰度数码显微图像分析系统（北京利金阳科技发展有限公司），PL203型精密电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]，EG1150H型生物组织包埋机、RM 21351型切片机（德国Leica公司），B071型光学显微镜（日本Olympus公司），DNM-9602型酶标仪（北京普朗有限公司），BR162123型电泳仪（美国Bio-Rad公司），LAS-500型凝胶成像系统（美国GE公司）。
1.2 主要药品与试剂
Cur原料药（批号TZSW200317-1，纯度99.0%）购自西安通泽生物科技有限公司;雷帕霉素（批号H12J10J79598，纯度99%）购自上海源叶生物科技有限公司;大鼠血管紧张素转换酶（ACE）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒、精氨酸加压素（AVP）ELISA试剂盒、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）ELISA试剂盒、兔抗大鼠LC3单克隆抗体（批号分别为9J2811、9J2811、9J2811、6N26）均购自美国SAB公司;细胞裂解液试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号分别为P00138、P0010）均购自上海碧云天生物技术有限公司;生物素标记的山羊抗兔免疫球蛋白G抗体（二抗）、兔抗大鼠β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（批号分别为201806、BM0627）购自武汉博士德生物有限公司;超敏ECL化学发光试剂盒（批号17122220）购自沈阳万类生物科技有限公司;兔抗大鼠Beclin-1单克隆抗体（批号3507223001）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司;兔SP试剂盒（兔链霉卵白素-生物素法检测系统）（批号K197713D）购自北京中杉金桥生物技术有限公司;其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为娃哈哈纯净水。
1.3 实验动物
本研究所用实验动物为SPF级SD大鼠，雄性，体质量220～240 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号为SCXK（京）2016-0006。所有动物均正常摄食、饮水。
2 方法
2.1 Cur-SLN的制备
采用微乳法进行制备[9]。称取Cur原料药50 mg、硬脂酸0.5 g，于65 ℃条件下熔化;再加入4倍量（V/V）相同温度的聚山梨酯80乙醇溶液和适量水，涡旋1 min，制成水包油（O/W）型微乳。在电磁搅拌（1 000 r/min）下，将上述微乳以5 s/滴的速度滴入2 ℃的水中;当微乳全部加入后，继续搅拌15 min，即得Cur-SLN混悬液（以Cur计，质量浓度为0.77 mg/mL，载药量为7.72%）。
2.2 分组、造模与给药
将大鼠适应性喂养7 d后，分为假手术组、模型组、雷帕霉素组（阳性对照，2 mg/kg，剂量参考文献[10]设置）和Cur-SLN低、高剂量组（5、10 mg/kg，剂量参考文献[11-12]设置），除模型组13只外，其余各组均10只。除假手术组外，其余各组大鼠均采用腹主动脉缩窄合并肾急性缺血再灌注损伤法复制心肾综合征模型。具体造模方法如下：大鼠腹腔注射45 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，行腹部正中切开，沿腹白线进入腹腔，暴露分离左、右侧肾蒂，阻断结扎30 min后，解除阻断，恢复血流，造成肾急性缺血再灌注损伤;随后，暴露分离后腹膜，沿游离腹主动脉长轴置一折弯的7号针头，以3-0的丝线绕腹主动脉后与7号针头一起结扎，随后立即抽出针头，使腹主动脉残留直径为0.7 mm的残腔，造成腹主动脉狭窄[13]。假手术组只同法分离肌肉、血管，但不阻断。术后，在各组大鼠腹腔内滴入青霉素以预防感染，然后分层关闭腹腔。造模8周后，取3只模型组大鼠，剖解其心肾组织进行观察，当出现心肌肥厚、肾肿大时，则表明造模成功。造模成功后，各给药组大鼠均尾静脉注射相应药物（注射体积为1 mL/kg），假手术组和模型组大鼠同法注射等体积生理盐水，每天1次，连续4周。 2.3 大鼠血清中ACE、FT3、AVP的含量测定
末次给药24 h后，将大鼠麻醉，于腹主动脉取血。血样静置30 min 后，以3 500 r/min离心10 min，取上层血清，按ELISA试剂盒说明书相关方法操作，采用酶标仪于450 nm波长下测定血清中ACE、FT3、AVP的含量。
2.4 大鼠心脏、肾、肺指数的测定
取血完成后，处死大鼠，取其心脏、肾、肺组织;分离心肌组织后，称定心脏湿质量、肾湿质量、肺湿质量，然后计算各脏器指数（脏器指数=脏器湿质量/体质量×100%）。
2.5 大鼠心脏、肾、肺组织病理学形态观察
取“2.4”项下各组大鼠心脏、肾、肺组织适量，置于4%多聚甲醛溶液中固定，经70%、80%、90%、95%乙醇和无水乙醇梯度脱水，再以二甲苯透明替换、浸蜡、包埋、切片（厚度约5 μm）。各组大鼠均取2张相应脏器切片进行苏木精-伊红（HE）染色（另外3张切片后续进行免疫组化实验），然后于光学显微镜下观察其心脏、肾、肺组织的病理学形态。
2.6 大鼠心脏、肾、肺组织中细胞自噬相关因子的表达分布检测
采用免疫组化法进行检测。取“2.5”项下各组大鼠另外3张相应脏器切片，经脱蜡并复水后，以磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗5 min×3次，滴加3%H2O2，室温静置10 min;以PBS冲洗5 min×3次，置于枸橼酸钠溶液中煮沸10 min以热修复抗原;冷却后以PBS冲洗5 min×3次，滴加山羊血清进行封闭，室温静置 20 min;甩去多余液体，滴加 LC3、Beclin-1一抗（稀释度均为1 ∶ 500）50 ?L，室温静置1 h;以PBS冲洗5 min×3次，滴加二抗，室温孵育15 min;以PBS缓冲液冲洗3 min×3次，滴加辣根酶标记的链霉卵白素-生物素免疫复合物适量，室温孵育15 min;以PBS缓冲液冲洗3 min×3次，加入DAB显色液适量，室温孵育8 min;采用光学显微镜进行观察，并拍照。当切片中呈现明显的棕黄色颗粒则为阳性表达，呈现不着色或浅色则为阴性表达。
2.7 大鼠心脏、肾、肺组织中细胞自噬相关因子的表达水平检测
采用Western blot法进行检测。取“2.4”项下各组大鼠心脏、肾、肺组织适量，经剪碎、裂解后，以12 000 r/min离心5 min;取上清液，以BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。蛋白经变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE），然后转膜 70 min，以 5%牛血清白蛋白溶液室温封闭 2 h;以 TBST洗膜 5 min×3 次，加入LC3、Beclin-1、β-actin一抗（稀释度均为1 ∶ 500），4 ℃孵育过夜;以TBST洗膜5 min×3次，加入二抗（稀释度为1 ∶ 2 000），室温孵育1 h;以TBST洗膜5 min×3次，经ECL试剂显色后，置于凝胶成像系统中曝光成像。采用Image J 1.8.0软件对蛋白条带的灰度值进行分析，以 LC3、Beclin-1分别与内参β-actin灰度值的比值表示相应蛋白的表达水平。
2.8 统计学方法
采用SPSS 21.0 对数据进行统計分析，数据以x±s表示。多组间比较，若数据符合正态分布且方差齐性，则采用单因素方差分析;若方差不齐，则采用Kruskal- Wallis H检验。组间两两比较采用LSD检验。检验水准α=0.05。
3 结果
3.1 大鼠血清中ACE、FT3、AVP含量的测定结果
与假手术组比较，模型组大鼠血清中ACE、FT3含量均显著升高（P<0.01），AVP含量显著降低（P<0.01）。与模型组比较，雷帕霉素组和Cur-SLN各剂量组大鼠血清中ACE、FT3含量均显著降低（P<0.05或P<0.01），AVP含量（雷帕霉素组除外）均显著升高（P<0.05）。结果见表1。
3.2 大鼠心脏、肾、肺指数的测定结果
与假手术组比较，模型组大鼠心脏指数、肾指数均显著升高（P<0.01），肺指数显著降低（P<0.01）。与模型组比较，雷帕霉素组和Cur-SLN各剂量组大鼠心脏指数、肾指数均显著降低（P<0.01），肺指数（Cur-SLN高剂量组除外）均显著升高（P<0.05或P<0.01）。结果见表2。
3.3 大鼠心脏、肾、肺组织病理学形态观察结果
假手术组大鼠心肌细胞排列正常、间质均一;肾小管结构完整，肾小球形态正常，无扩张萎缩现象;肺泡形态大小正常，无充血及炎性细胞浸润。模型组大鼠心非梗死区心肌细胞明显肥大，心肌纤维排列紊乱，细胞间质可见局灶性纤维化及炎性细胞浸润;肾非梗死区肾小管结构紊乱、呈囊性扩张、上皮萎缩，肾小球增大、结构模糊;肺泡可见明显炎性细胞浸润。雷帕霉素组和Cur-SLN各剂量组大鼠心脏、肾、肺组织的病理改变程度均较模型组减轻，炎性细胞浸润减少。结果见图1。
3.4 大鼠心脏、肾、肺组织中细胞自噬相关因子的表达分布检测结果
在大鼠心脏组织中，假手术组LC3、Beclin1蛋白的阳性表达较低，少数分布于心肌细胞的细胞质中;模型组上述蛋白的阳性表达相较于假手术组增多，主要分布于心肌细胞的细胞质中;各给药组上述蛋白的阳性表达相较于模型组减少，主要分布于心肌细胞的细胞质中。在大鼠肾组织中，假手术组上述蛋白的阳性表达较少，主要分布于肾小管和肾小球细胞中;模型组上述蛋白的阳性表达相较于假手术组增多，主要分布于远端肾小管上皮细胞中;各给药组上述蛋白的阳性表达相较于模型组减少，主要分布于近端肾小管上皮细胞中，少数分布于远端肾小管上皮细胞中。在大鼠肺组织中，假手术组上述蛋白的阳性表达较少，主要分布于上皮细胞;模型组上述蛋白的阳性表达相较于假手术组增多，主要分布于肺泡巨噬细胞和上皮细胞中;各给药组上述蛋白阳性表达相较于模型组减少，少数分布于肺泡巨噬细胞和上皮细胞中。结果见图2。 3.5 大鼠心脏、肾、肺组织中细胞自噬相关因子的表达水平检测结果
与假手术组比较，模型组大鼠心脏、肾、肺组织中LC3（肾组织中除外）、Beclin-1蛋白的表达水平均显著升高（P<0.01）。与模型组比较，雷帕霉素组和Cur-SLN各剂量组大鼠心、肾、肺组织中LC3（肾组织中除外）、Beclin-1（Cur-SLN低剂量组肾组织中除外）蛋白表达水平均显著降低（P<0.05或P<0.01）。结果见图3、表3。
4 讨论
心肾综合征是临床常见的心肾交集或复合型疾病，因其发病率高、病死率高、治疗费用昂贵，已成为全球公共健康的重要问题[14]。心肾纤维化是心肾综合征疾病进展到终末期的重要途径和主要病理改变基础[13]。相关研究发现，姜黄素具有调节组织细胞凋亡和自噬功能的作用，还可减轻血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化和肾间质纤维化[15]，但其是否能通过调控细胞自噬来治疗心肾综合征，尚不明确。因此，本研究在制备Cur-SLN的基础上，初步探讨其对心肾综合征模型大鼠心、肾、肺功能及细胞自噬相关因子表达的影响。
有研究提示，FT3水平升高可以间接激活肾素- ACE-醛固酮系统，加重水钠潴留的状态，进一步影响心肌肥大的病理程度，使得肺氧浓度降低、动脉血管收缩、AVP含量降低，进而导致病情加重[16-18]。本研究结果显示，经Cur-SLN干预后，心肾综合征模型大鼠血清中ACE、FT3含量和心脏指数、肾指数均显著降低，AVP含量和肺指数均显著升高，心脏、肾、肺组织病理改变程度均较模型组减轻、炎性细胞浸润减少，表明Cur-SLN能有效改善心肾综合征模型大鼠的心肌肥大、肾功能以及肺组织损伤。
Beclin-1的表达与自噬体数目相关，其表达水平越高，则细胞内自噬体的数目就越多[19]。研究表明， Beclin-1在抑制肿瘤和预防心血管疾病、退行性疾病等方面均具有重要作用[20-21]。LC3是哺乳动物自噬相关基因8（Atg8）的同源物，LC3靶向定位于自噬体膜，参与自噬体的形成[22]。本研究结果显示，经Cur-SLN干预后，大鼠心脏、肾、肺组织中LC3、Beclin-1的阳性表达均较模型组减少，主要分布于心肌细胞细胞质中、近端肾小管上皮细胞中，少数分布于远端肾小管上皮細胞和肺泡巨噬细胞、上皮细胞中。进一步研究显示，经Cur-SLN干预后，模型大鼠心脏、肾、肺组织中LC3（肾组织中除外）、Beclin-1（Cur-SLN低剂量组肾组织中除外）蛋白表达水平均显著降低，表明Cur-SLN可通过调控细胞自噬相关因子表达水平，改善模型大鼠的心肌肥大、肾功能以及肺组织损伤。
综上所述，Cur-SLN 可改善心肾综合征模型大鼠的心、肾、肺功能，其作用机制可能与调控LC3、Beclin-1蛋白在心脏、肾、肺组织中的分布或表达有关。
参考文献
[ 1 ] CLEMENTI A，VIRZ? G M，BATTAGLIA G G，et al. Neurohormonal，endocrine，and immune dysregulation and inflammation in cardiorenal syndrome[J]. Cardiorenal Med，2019，9（5）：265-273.
[ 2 ] 刘高仁，李鲜.温阳利水汤对急性心力衰竭合并1型心肾综合征患者心肾功能保护效应[J].陕西中医，2019，40（4）：462-465.
[ 3 ] 李宜醒，姚伟静，易聪.细胞自噬研究进展[J].中国细胞生物学学报，2019，41（2）：192-201.
[ 4 ] 李旭，王梓，郝迪，等.参附强心丸对心肾综合征模型大鼠心肌细胞中LC3b、Bax表达的影响[J].中国药房，2016，27（19）：2602-2605.
[ 5 ] HASSANZADEH S，READ M I，Bland A R，et al. Curcumin：an inflammasome silencer[J]. Pharmacol Res，2020，159：104921.
[ 6 ] YAO Q，KE Z，GUO S，et al. Curcumin protects against dia- betic cardiomyopathy by promoting autophagy and alle- viating apoptosis[J]. J Mol Cell Cardiol，2018，124：26-34.
[ 7 ] MEHTA P，BOTHIRAJA C，MAHADIK K，et al. Phytoconstituent based dry powder inhalers as biomedicine for the management of pulmonary diseases[J]. Biomed Pharmacother，2018，108：828-837.
[ 8 ] MU H，HOLM R. Solid lipid nanocarriers in drug deli- very：characterisation and design[J]. Expert Opin Drug Deliv，2018，15（8）：771-785.
[ 9 ] 李楠，李旭，刘伟伟，等.姜黄素固体脂质纳米粒干粉吸入剂的体外释药、体内急性毒性及对哮喘模型小鼠炎症反应的影响[J].中国药房，2019，30（3）：332-338.
[10] 谢阳，张淑江，刘梦兰，等.雷帕霉素保护实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脊髓神经元的作用途径[J].中国组织工程研究，2021，25（5）：695-700.
[11] 吴鹏波，宋琪，俞媛洁，等.姜黄素激活自噬干预非酒精性脂肪肝病模型大鼠氧化应激及炎症反应[J].中国组织工程研究，2020，24（11）：1720-1725. [12] 宋莉平，王宇.姜黄素药理作用及机制研究进展[J].中国医药导报，2020，17（20）：29-34.
[13] 吴英智，杭丽玮，傅强，等.新型心肾综合征大鼠动物模型建立与评价[J].中华高血压杂志，2018，26（5）：435-442.
[14] DI LULLO L，BELLASI A，RUSSO D，et al. Cardiorenal acute kidney injury：epidemiology，presentation，causes，pathophysiology and treatment[J]. Int J Cardiol，2017，227：143-150.
[15] 范沐霞，赵塔娜，王丽敏，等.姜黄素抗纤维化研究进展[J].中医学报，2019，34（11）：2343-2348.
[16] 郑甲林，张新金，郭涛，等.甲亢源性心房颤动与肾素-血管紧张素系统相关发病机制的研究[J].现代生物医学进展，2021，21（2）：228-232.
[17] 黄钰.甲状腺激素与肾脏病理生理在肾脏疾病中的作用[J].临床内科杂志，2021，38（2）：139-141.
[18] 杜晓敏，翟磊.血液超滤对心肾综合征病人心肺功能及相关指标的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2019，17（11）：1744-1747.
[19] 孙大伟，索艳荣，冯丽莎，等.基于自噬基因Beclin-1与LC3探讨丹参素对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌ATP5G1的影响[J].中华中医药杂志，2019，34（6）：2421-2425.
[20] YUAN B，SUN M，BAO C，et al. Dynamic expression of autophagy-related factors in autoimmune encephalomyelitis and exploration of curcumin therapy[J]. J Neuroimmunol，2019，337：577067.
[21] DENG Q，LIANG L，LIU Q，et al. Autophagy is a major mechanism for the dual effects of curcumin on renal cell carcinoma cells[J]. Eur J Pharmacol，2018，826：24-30.
[22] 郜然然，周慧，吳也可，等.中医药通过mTOR途径调节细胞凋亡与自噬的研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2019，25（4）：218-224.
（收稿日期：2021-04-02 修回日期：2021-08-09）
（编辑：唐晓莲）
基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.81903565）;天津市自然科学基金资助项目（No.18JCQNJC13500）;天津市卫生健康委员会科技项目（No.KJ20082）
助理研究员，硕士。研究方向：药理学。电话：022-27236137。E-mail：187391856@qq.com
通信作者：助理研究员。研究方向：药剂学。E-mail：llittlsnows@126.com