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采用 TRIzol试剂一步法所抽提的总 RNA的 D(260)/D(280)值为 1.82,甲醛变性电泳呈现真核微生物所特有的 28S rRNA和 18S rRNA 条带.根据扩展青霉所产碱性脂肪酶(Lip PE)N末端 20个氨基酸残基序列和真核生物 mRNA3’端具有 poly(A)等所提供的生物信息,采用 RT-PCR技术和 3’-RACE法扩增了 LipPE成熟肽编码区和3’非纪码区的cDNA,直接将该PCR产物克隆至pUCm-T载体中。序列分析表明,该碱性脂肪酶含有258个氨基酸,其中保守的五肽序列为 Gly-His-Ser-Leu-Gly。进一步采用 ClonTech公司的 SMART~(TM)PCR cDNA文库构建试剂盒,扩增、克隆和测定了自转录起始点至纪码区的 cDNA片段,从而完成了 Lip EP完整 cDNA的分析测定.最后将编码完整脂肪酶蛋白的cDNA克隆至 pGEX-5X-3表达载体中.在大肠杆菌 BL21中进行 IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测结果表明,所表达的 GST-Lip EP融合蛋白分子质量约为 53ku;免疫印迹(WesternBlotting)技术证明了所克隆的cDNA确为编码扩展青霉WMC2