【摘 要】
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为获得阿昌族G6PDWT和G6PDG487A重组蛋白,研究G6PDG487A的结构和功能改变,从云南省德宏州梁河县杞木寨乡湾中村阿昌族聚集地的G6PD缺陷家系先证者和正常阿昌族个体全血提取RN
【机 构】
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昆明医学院生化教研室,昆明,650031中国医学科学院医学生物学研究所,昆明,650018;
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为获得阿昌族G6PDWT和G6PDG487A重组蛋白,研究G6PDG487A的结构和功能改变,从云南省德宏州梁河县杞木寨乡湾中村阿昌族聚集地的G6PD缺陷家系先证者和正常阿昌族个体全血提取RNA,经RT-巢式PCR得cDNA,将cDNA克隆至pMD18-T simple载体中并测序;错配碱基经定点突变修复后,目的基因亚克隆至pThioHis(A)载体,构建了阿昌族G6PD基因野生型和G487A突变型原核表达载体:pThioHis(A)-AChang-G6PDWT和pThioHis(A)-AChang-G6PDG487A.用重组质粒转化E.coli Competent Cells DF213(G6PD defeciency),经IPTG诱导G6PD表达、10%SDS-PAGE电泳检测表达蛋白和紫外340 nm定量测定G6PD活性的分析表明,pThioHis(A)-AChang-G6PDWr和pThioHis(A)-AChang-G6PDG487A在DF213中成功表达,分子量约为59 kDa.IPTG诱导0、3、6、9、和12 h后,G6PD活性逐渐增高,G6PD基因WT表达的酶活性约是G487A的20～25倍.表达载体的构建以及G6PD cDNA在DF213中成功表达,为重组酶G6PDG487A的进一步研究奠定了基础.
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