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摘要：研究了多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑病菌（Alternaria kikuchiana）的抑制作用，并对其应用效果进行了评价。结果表明，多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑病菌的体外抑制率为53.2%，其粗提蛋白严重破坏了梨黑斑病菌的菌丝和孢子，显著抑制了梨采后黑斑病的发生，呈现出极大的应用潛力。
关键词：梨；黑斑病；多黏类芽孢杆菌；生物防治
中图分类号： TS201.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0107-03
梨黑斑病是一种由链格孢菌（Alternaria kikuchiana）引起的世界性气传真菌病害，主要侵染叶片，造成大量落叶，也危害果实和新梢，严重危害果品的生产和储存。我国是梨种植和出口大国，梨产量约占世界总产量的2/3，出口量约占世界总出口量的1/6，梨的出口是增加国民生产总值、农民收入的重要途径。然而，病原微生物的侵染造成梨采后腐烂损失严重[1]。其中，黑斑病是梨采后的重要病害之一，严重时可使梨采后损失达50%以上，在我国和韩国都曾严重暴发[2]。近年，法国也发现有梨黑斑病的发生与危害[3]。目前，农业上主要使用化学杀菌剂来控制病害发生。然而，大量使用化学农药引起的病菌抗药性、食品中农药残留超标、环境污染等问题日益严重。因此，寻求高效、安全的生物杀菌制剂成为防治农作物、果蔬等病害的主要出路之一，也是近年来研究的热点[4-8]。
多黏类芽孢杆菌对植物具有非致病性，且细胞壁不含内毒素，对人畜无害，在产品开发中活菌数量高、性能稳定，是一种理想的生防菌。多黏类芽孢杆菌HT16 是笔者所在实验室分离并保存的1株能有效抑制真菌病害的菌株。前期试验表明，该菌及发酵液对多种植物病原菌具有广谱的抑制作用，其抗菌物质为耐热、耐酸碱、耐紫外线的蛋白质[9]。本研究评价了多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑病菌的抑制活性及对梨采后黑斑病的控制效果，并探讨其抑菌机理，为进一步深入研究其生防效果和开发微生物农药奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
供试梨为河北省赵县白梨（水晶梨）。供试生防菌株多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa） HT16由笔者所在实验室保存，梨黑斑病病原菌由河北农业大学植物保护学院提供。
仪器设备包括BM-103CE光学显微镜，上海比目仪器有限公司；YT-CJ-1N 超净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SYQ-DSX-280B 不锈钢手提式，山东新华医疗器械厂；TCL-15B离心机，上海安亭科学仪器厂；生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；pH211 酸度计，压力蒸汽灭菌锅等。
1.2 培养基
发酵培养基[10]：马铃薯30%，（NH4）2SO4 0.4%，蔗糖 1.5%，K2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，黄豆饼粉0.1%，pH值6.5。PDA培养基：葡萄糖2%、马铃薯20%、琼脂2%、1 000 mL 蒸馏水，pH值6.5。PDB培养基（种子培养基）：葡萄糖2%、马铃薯20%、1 000 mL 蒸馏水，pH值6.5。
1.3 多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑病病原菌的抑制活性
1.3.1 菌体抑制活性的测定 采用对峙法测定HT16对梨黑斑病病原菌的抑制活性。将梨黑斑病病原菌接种于PDA平板上，置于25 ℃条件下培养7 d。在平板培养物上用打孔器取直径6 mm的菌块，接种在另一PDA平板中央，将HT16菌株均匀接种于距平板边缘20 mm处的4个点上，28 ℃培养7 d，采用十字交叉法测量病原菌直径，以不接种HT16的PDA平板作对照，参照文献[10]计算抑菌率，抑菌率= （对照病菌直径-处理病菌直径-6 mm）/对照病原菌直径×100%。每个处理作3个重复，该试验重复3次。
1.3.2 不同处理液抑菌活性的测定
1.3.2.1 HT16发酵液的制备 将24 h 种龄的HT16 种子培养液以体积分数为10% 的接种量转接到液体发酵培养基中，置于30 ℃培养箱中，186 r/min 振荡培养72 h，备用。
1.3.2.2 HT16菌悬液的制备 将培养24 h的HT16种子培养液，以8 000 r/min离心10 min，弃上清，菌体沉淀以无菌水清洗2次，离心，最终以无菌生理盐水调节菌体浓度 1亿CFU/mL 左右，备用。
1.3.2.3 蛋白粗提液的制备 将上述HT16发酵液以 8 000 r/min 离心10 min，取上清，用6 mol/L HCl 调pH值至2.5，并用80%硫酸铵沉淀，4 ℃静置过夜；然后在4 ℃条件下，10 000 r/min离心15 min，弃上清液；沉淀用1/20发酵液体积的磷酸盐缓冲液（pH值7.2）溶解，装入透析袋，透析过夜；用固体聚乙二醇2000进行浓缩，浓缩至原体积的1/5，作为HT16发酵液的粗提蛋白，备用。
1.3.2.4 不同处理液抑菌活性的测定 将100 μL梨黑斑病病原菌的孢子悬液（孢子浓度约10万个/mL）均匀涂布于 20 mL PDA培养基上，晾干后，放入牛津杯，分别加入上述不同处理液，28 ℃培养2 d，观察测量抑菌圈大小。
1.4 多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑病发病率的抑制
选取个体均匀、表面无明显损伤且未发病的梨果实，以2%次氯酸钠进行表面消毒，并以水清洗，晾干备用。
在梨果实的腰部两侧进行无菌刺伤接种，伤口大小约为3 mm（直径）×3 mm（深）。向伤口中注入100 μL上述不同处理液，以无菌水作为对照。晾干后再向同一个伤口上接种50 μL梨黑斑病病原菌的孢子悬液（孢子浓度约为10万个/mL），室温下晾干后，将果实放入有隔层的纸箱内，并在纸箱外套上塑料袋使其保持相对湿度（90±5）%，置于28 ℃下贮藏。每隔24 h观察1次，记录病斑直径并计算发病率。 发病率=发病果个数/调查个数×100%。
1.5 多黏类芽孢杆菌HT16的抑菌机理
1.5.1 HT16对梨黑斑病病原菌孢子萌发的影响 将2 mL梨黑斑病病原菌的孢子悬液（孢子浓度约为10万个/mL）加入到灭菌的2 mL PDB培养基中，同时接种500 μL上述蛋白粗提液，以不加蛋白粗提液的作為对照，28 ℃下150 r/min振荡培养14 h，在显微镜下观察孢子萌发情况。
孢子萌发率=萌发孢子个数/观察孢子个数×100%。
1.5.2 HT16对梨黑斑病病原菌菌丝生长的影响 将 500 μL 梨黑斑病病原菌的孢子悬液（孢子浓度10万个/mL左右）加入到灭菌的50 mLPDB培养基中，于28 ℃下 150 r/min 振荡培养24 h，加入500 μL蛋白粗提液，继续培养8 h，在扫描电镜下比较菌丝的生长情况[11]。以不加蛋白粗提液的作为对照。
2 结果与分析
2.1 多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑病病原菌的抑制效果
由图1可以看出，多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑病病原菌表现出很强的抑制效果，其抑制率为53.2%。多黏类芽孢杆菌HT16的不同处理液对梨黑斑病病原菌的生长也表现出不同的抑制作用（图2）。其中，HT16粗提蛋白的抑菌效果最显著，抑菌圈直径达到17.6 mm。HT16菌悬液和发酵液对梨黑斑病病原菌的抑菌圈直径分别为10.4、14.7 mm。
2.2 多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑病发病率的影响
对健康的梨果实进行刺伤，接种不同的处理液后，接种黑斑病病原菌，再进行贮藏，结果如图3、图4所示。由图3可以看出，多黏类芽孢杆菌HT16的发酵液、菌悬液、蛋白粗提液对梨黑斑病病原菌均有不同程度的抑制效果，处理组的梨黑斑病发病率明显低于对照。在保存的第2天，对照和菌悬液组的梨发病率达到100%，发酵液处理组的梨发病率为 83.3%，而蛋白粗提液处理的梨果实未发病。保存到第12天，对照的梨黑斑病病斑直径达到 39.61 mm，而发酵液组、菌悬液组、蛋白粗提液组的梨黑斑病病斑直径分别为36.53、35.17、0 mm。由此可以看出，粗提蛋白抑菌效果最好，无发病状况。菌悬液处理后的伤口梨黑斑生长旺盛，发酵液处理组虽有伤口腐烂但无梨黑斑菌丝出现。可见，发酵液比菌悬液处理组更能抑制梨黑斑病菌的生长，这与体外抑菌结果一致。
2.3 多黏类芽孢杆菌HT16的抑菌机理
2.3.1 对孢子萌发的影响 多黏类芽孢杆菌HT16蛋白粗提液对梨黑斑菌病原菌孢子萌发的影响如图4所示。由图4-A中可以看出，梨黑斑的对照组孢子已经萌发，经测定其萌发率为96.67%，并生长出菌丝，而图4-B 中的孢子未萌发并且有消融现象出现。
2.3.2 对菌丝生长的影响 在扫描电镜下观察了HT16处理梨黑斑菌丝生长的形态，结果如图5所示。图5-B-1、图5-B-2为粗提蛋白处理后菌丝状况。由此可以看出，蛋白粗提液处理的梨黑斑菌丝扭曲并且萎缩，菌丝外表皮有脱落现象，菌丝变成畸形状态，且有断裂现象。而正常的菌丝光滑、均匀（图5-A-1、图5-A-2）。
3 结论与讨论
对峙法和牛津杯法的结果均显示，多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑病菌链格孢菌有显著的抑制作用。HT16菌悬液、发酵液和粗提蛋白对梨采后黑斑病均表现出一定的抑制效果。其中，粗提蛋白的效果最显著。扫描电镜和电子显微镜观察发现，粗提蛋白处理过的病原菌孢子基本不萌发，并有消融现象，且菌丝扭曲、萎缩，菌丝外表皮出现脱落和断裂。这些结果显示了多黏类芽孢杆菌HT16作为生防细菌的可行性。
HT16菌株发酵过程中产生的粗提蛋白对梨采后黑斑病的防治效果非常显著， 抑菌机制试验也证实了粗提蛋白对梨黑斑及其孢子和菌丝的抑制作用。近年来，利用微生物自身的拮抗、竞争作用及其产生的抗菌蛋白防治果蔬采前和采后病原真菌的报道很多。其中，枯草芽孢杆菌H110的粗提蛋白对梨采后因青霉菌和黑斑病菌引起的腐败表现出很好的抑制效果[10]。周防震将番茄表面分离到的酵母菌L-1-6和 H-2 用于控制番茄的腐败，菌悬液处理后的番茄腐烂率、失水率和总损耗均显著降低，对采后番茄的根霉病及早疫病病害的控制也起到了显著效果[12]。Wichitea等报道，分离自土壤中的枯草芽孢杆菌对柑橘类水果由青霉引起的病害抑制效果显著[13]。Arun等发现，毕赤酵母和假丝酵母对炭疽病菌有防治作用，能显著降低辣椒炭疽及其他病害的发病率[14]。细菌 P-FS08 所产生的拮抗蛋白对果蔬和粮食作物致病真菌也表现出广谱的抑菌作用，可使病原菌菌丝断裂、原生质体浓缩[15]。但对于多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑的防治未见报道。
为使菌株真正在生产中应用，达到有效防治果蔬采前和采后病害的目的，在后续研究中还将对该菌株及其产生的抗菌物质进行安全性评价，同时联合农业相关企业尝试开发该微生物制剂，探讨该菌株与其他物质如壳聚糖、水杨酸等[16-17]的联合使用效果和使用方式，并进行田间药效试验，以期为生物农药的研发和应用提供理论基础和实际参考，为果蔬病害的生物防治及食品安全提供保障。
参考文献：
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关键词：梨；黑斑病；多黏类芽孢杆菌；生物防治
中图分类号： TS201.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0107-03
梨黑斑病是一种由链格孢菌（Alternaria kikuchiana）引起的世界性气传真菌病害，主要侵染叶片，造成大量落叶，也危害果实和新梢，严重危害果品的生产和储存。我国是梨种植和出口大国，梨产量约占世界总产量的2/3，出口量约占世界总出口量的1/6，梨的出口是增加国民生产总值、农民收入的重要途径。然而，病原微生物的侵染造成梨采后腐烂损失严重[1]。其中，黑斑病是梨采后的重要病害之一，严重时可使梨采后损失达50%以上，在我国和韩国都曾严重暴发[2]。近年，法国也发现有梨黑斑病的发生与危害[3]。目前，农业上主要使用化学杀菌剂来控制病害发生。然而，大量使用化学农药引起的病菌抗药性、食品中农药残留超标、环境污染等问题日益严重。因此，寻求高效、安全的生物杀菌制剂成为防治农作物、果蔬等病害的主要出路之一，也是近年来研究的热点[4-8]。
多黏类芽孢杆菌对植物具有非致病性，且细胞壁不含内毒素，对人畜无害，在产品开发中活菌数量高、性能稳定，是一种理想的生防菌。多黏类芽孢杆菌HT16 是笔者所在实验室分离并保存的1株能有效抑制真菌病害的菌株。前期试验表明，该菌及发酵液对多种植物病原菌具有广谱的抑制作用，其抗菌物质为耐热、耐酸碱、耐紫外线的蛋白质[9]。本研究评价了多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑病菌的抑制活性及对梨采后黑斑病的控制效果，并探讨其抑菌机理，为进一步深入研究其生防效果和开发微生物农药奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
供试梨为河北省赵县白梨（水晶梨）。供试生防菌株多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa） HT16由笔者所在实验室保存，梨黑斑病病原菌由河北农业大学植物保护学院提供。
仪器设备包括BM-103CE光学显微镜，上海比目仪器有限公司；YT-CJ-1N 超净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SYQ-DSX-280B 不锈钢手提式，山东新华医疗器械厂；TCL-15B离心机，上海安亭科学仪器厂；生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；pH211 酸度计，压力蒸汽灭菌锅等。
1.2 培养基
发酵培养基[10]：马铃薯30%，（NH4）2SO4 0.4%，蔗糖 1.5%，K2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，黄豆饼粉0.1%，pH值6.5。PDA培养基：葡萄糖2%、马铃薯20%、琼脂2%、1 000 mL 蒸馏水，pH值6.5。PDB培养基（种子培养基）：葡萄糖2%、马铃薯20%、1 000 mL 蒸馏水，pH值6.5。
1.3 多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑病病原菌的抑制活性
1.3.1 菌体抑制活性的测定 采用对峙法测定HT16对梨黑斑病病原菌的抑制活性。将梨黑斑病病原菌接种于PDA平板上，置于25 ℃条件下培养7 d。在平板培养物上用打孔器取直径6 mm的菌块，接种在另一PDA平板中央，将HT16菌株均匀接种于距平板边缘20 mm处的4个点上，28 ℃培养7 d，采用十字交叉法测量病原菌直径，以不接种HT16的PDA平板作对照，参照文献[10]计算抑菌率，抑菌率= （对照病菌直径-处理病菌直径-6 mm）/对照病原菌直径×100%。每个处理作3个重复，该试验重复3次。
1.3.2 不同处理液抑菌活性的测定
1.3.2.1 HT16发酵液的制备 将24 h 种龄的HT16 种子培养液以体积分数为10% 的接种量转接到液体发酵培养基中，置于30 ℃培养箱中，186 r/min 振荡培养72 h，备用。
1.3.2.2 HT16菌悬液的制备 将培养24 h的HT16种子培养液，以8 000 r/min离心10 min，弃上清，菌体沉淀以无菌水清洗2次，离心，最终以无菌生理盐水调节菌体浓度 1亿CFU/mL 左右，备用。
1.3.2.3 蛋白粗提液的制备 将上述HT16发酵液以 8 000 r/min 离心10 min，取上清，用6 mol/L HCl 调pH值至2.5，并用80%硫酸铵沉淀，4 ℃静置过夜；然后在4 ℃条件下，10 000 r/min离心15 min，弃上清液；沉淀用1/20发酵液体积的磷酸盐缓冲液（pH值7.2）溶解，装入透析袋，透析过夜；用固体聚乙二醇2000进行浓缩，浓缩至原体积的1/5，作为HT16发酵液的粗提蛋白，备用。
1.3.2.4 不同处理液抑菌活性的测定 将100 μL梨黑斑病病原菌的孢子悬液（孢子浓度约10万个/mL）均匀涂布于 20 mL PDA培养基上，晾干后，放入牛津杯，分别加入上述不同处理液，28 ℃培养2 d，观察测量抑菌圈大小。
1.4 多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑病发病率的抑制
选取个体均匀、表面无明显损伤且未发病的梨果实，以2%次氯酸钠进行表面消毒，并以水清洗，晾干备用。
在梨果实的腰部两侧进行无菌刺伤接种，伤口大小约为3 mm（直径）×3 mm（深）。向伤口中注入100 μL上述不同处理液，以无菌水作为对照。晾干后再向同一个伤口上接种50 μL梨黑斑病病原菌的孢子悬液（孢子浓度约为10万个/mL），室温下晾干后，将果实放入有隔层的纸箱内，并在纸箱外套上塑料袋使其保持相对湿度（90±5）%，置于28 ℃下贮藏。每隔24 h观察1次，记录病斑直径并计算发病率。 发病率=发病果个数/调查个数×100%。
1.5 多黏类芽孢杆菌HT16的抑菌机理
1.5.1 HT16对梨黑斑病病原菌孢子萌发的影响 将2 mL梨黑斑病病原菌的孢子悬液（孢子浓度约为10万个/mL）加入到灭菌的2 mL PDB培养基中，同时接种500 μL上述蛋白粗提液，以不加蛋白粗提液的作為对照，28 ℃下150 r/min振荡培养14 h，在显微镜下观察孢子萌发情况。
孢子萌发率=萌发孢子个数/观察孢子个数×100%。
1.5.2 HT16对梨黑斑病病原菌菌丝生长的影响 将 500 μL 梨黑斑病病原菌的孢子悬液（孢子浓度10万个/mL左右）加入到灭菌的50 mLPDB培养基中，于28 ℃下 150 r/min 振荡培养24 h，加入500 μL蛋白粗提液，继续培养8 h，在扫描电镜下比较菌丝的生长情况[11]。以不加蛋白粗提液的作为对照。
2 结果与分析
2.1 多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑病病原菌的抑制效果
由图1可以看出，多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑病病原菌表现出很强的抑制效果，其抑制率为53.2%。多黏类芽孢杆菌HT16的不同处理液对梨黑斑病病原菌的生长也表现出不同的抑制作用（图2）。其中，HT16粗提蛋白的抑菌效果最显著，抑菌圈直径达到17.6 mm。HT16菌悬液和发酵液对梨黑斑病病原菌的抑菌圈直径分别为10.4、14.7 mm。
2.2 多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑病发病率的影响
对健康的梨果实进行刺伤，接种不同的处理液后，接种黑斑病病原菌，再进行贮藏，结果如图3、图4所示。由图3可以看出，多黏类芽孢杆菌HT16的发酵液、菌悬液、蛋白粗提液对梨黑斑病病原菌均有不同程度的抑制效果，处理组的梨黑斑病发病率明显低于对照。在保存的第2天，对照和菌悬液组的梨发病率达到100%，发酵液处理组的梨发病率为 83.3%，而蛋白粗提液处理的梨果实未发病。保存到第12天，对照的梨黑斑病病斑直径达到 39.61 mm，而发酵液组、菌悬液组、蛋白粗提液组的梨黑斑病病斑直径分别为36.53、35.17、0 mm。由此可以看出，粗提蛋白抑菌效果最好，无发病状况。菌悬液处理后的伤口梨黑斑生长旺盛，发酵液处理组虽有伤口腐烂但无梨黑斑菌丝出现。可见，发酵液比菌悬液处理组更能抑制梨黑斑病菌的生长，这与体外抑菌结果一致。
2.3 多黏类芽孢杆菌HT16的抑菌机理
2.3.1 对孢子萌发的影响 多黏类芽孢杆菌HT16蛋白粗提液对梨黑斑菌病原菌孢子萌发的影响如图4所示。由图4-A中可以看出，梨黑斑的对照组孢子已经萌发，经测定其萌发率为96.67%，并生长出菌丝，而图4-B 中的孢子未萌发并且有消融现象出现。
2.3.2 对菌丝生长的影响 在扫描电镜下观察了HT16处理梨黑斑菌丝生长的形态，结果如图5所示。图5-B-1、图5-B-2为粗提蛋白处理后菌丝状况。由此可以看出，蛋白粗提液处理的梨黑斑菌丝扭曲并且萎缩，菌丝外表皮有脱落现象，菌丝变成畸形状态，且有断裂现象。而正常的菌丝光滑、均匀（图5-A-1、图5-A-2）。
3 结论与讨论
对峙法和牛津杯法的结果均显示，多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑病菌链格孢菌有显著的抑制作用。HT16菌悬液、发酵液和粗提蛋白对梨采后黑斑病均表现出一定的抑制效果。其中，粗提蛋白的效果最显著。扫描电镜和电子显微镜观察发现，粗提蛋白处理过的病原菌孢子基本不萌发，并有消融现象，且菌丝扭曲、萎缩，菌丝外表皮出现脱落和断裂。这些结果显示了多黏类芽孢杆菌HT16作为生防细菌的可行性。
HT16菌株发酵过程中产生的粗提蛋白对梨采后黑斑病的防治效果非常显著， 抑菌机制试验也证实了粗提蛋白对梨黑斑及其孢子和菌丝的抑制作用。近年来，利用微生物自身的拮抗、竞争作用及其产生的抗菌蛋白防治果蔬采前和采后病原真菌的报道很多。其中，枯草芽孢杆菌H110的粗提蛋白对梨采后因青霉菌和黑斑病菌引起的腐败表现出很好的抑制效果[10]。周防震将番茄表面分离到的酵母菌L-1-6和 H-2 用于控制番茄的腐败，菌悬液处理后的番茄腐烂率、失水率和总损耗均显著降低，对采后番茄的根霉病及早疫病病害的控制也起到了显著效果[12]。Wichitea等报道，分离自土壤中的枯草芽孢杆菌对柑橘类水果由青霉引起的病害抑制效果显著[13]。Arun等发现，毕赤酵母和假丝酵母对炭疽病菌有防治作用，能显著降低辣椒炭疽及其他病害的发病率[14]。细菌 P-FS08 所产生的拮抗蛋白对果蔬和粮食作物致病真菌也表现出广谱的抑菌作用，可使病原菌菌丝断裂、原生质体浓缩[15]。但对于多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑的防治未见报道。
为使菌株真正在生产中应用，达到有效防治果蔬采前和采后病害的目的，在后续研究中还将对该菌株及其产生的抗菌物质进行安全性评价，同时联合农业相关企业尝试开发该微生物制剂，探讨该菌株与其他物质如壳聚糖、水杨酸等[16-17]的联合使用效果和使用方式，并进行田间药效试验，以期为生物农药的研发和应用提供理论基础和实际参考，为果蔬病害的生物防治及食品安全提供保障。
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