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摘 要 以去除种子后的桃金娘果实为试验材料，分别采用等体积的水与体积分数80%甲醇进行提取，测定2种提取物的总酚与总黄酮含量，并对2种提取物的DPPH自由基与ABTS自由基清除能力以及总抗氧化能力进行评价。结果表明，桃金娘果实的2种提取物均具有不同程度的多酚含量与抗氧化活性，体积分数80%甲醇提取物的总酚与总黄酮含量、DPPH与ABTS自由基清除能力以及总抗氧化能力均显著高于水提取物。研究结果表明，桃金娘果实多酚物质具有良好的抗氧化活性。
关键词 桃金娘果实；多酚；抗氧化活性；清除自由基
中图分类号 S667.9 文献标识码 A
Antioxidant Activity of Rhodomyrtus tomentosa Fruit Extracts
YANG Weihai1，2， LIU Suifei3， ZOU Minghong1，2， ZENG Hui1，2，
ZHANG Hanzhou1，2， LU Chaozhong1，2*
1 South Subtropical Crops Research Institute， CATAS， Zhanjiang， Guangdong 524091， China
2 Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture， Zhanjiang， Guangdong 524091， China
3 Jiang Xi Agricultural Engineering College， Zhangshu， Jiangxi 331200， China
Abstract The contents of the total phenolics and total flavonoids from the extracts of Rhodomyrtus tomentosa fruit without seeds were extracted with the same volume solvents water and 80% methanol and quantified. The antioxidant activities of the two extracts were screened using the total antioxidant capacity and the scavenging activities of DPPH and ABTS radicals. The results showed that both extracts of R. tomentosa fruit exhibited varying degrees of the polyphenol content and the antioxidant activity， the extractives from the 80% methanol exhibited significant higher contents of total phenolics， total flavonoids， stronger total antioxidant capacity and radical scavenging abilities on DPPH and ABTS than that from water. The results revealed that the polyphenol extractives from R. tomentosa fruit had good antioxidant activity.
Key words Rhodomyrtus tomentosa fruit；Polyphenols；Antioxidant activity；Radical scavenging
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.020
桃金娘[Rhodomyrtus tomentosa（Ait.）Hassk]，又称桃娘、岗稔、山稔、稔子、豆稔等，系桃金娘科（Myrtaceae）桃金娘属（Rhodomyrtus）常绿小灌木，主要分布于中国广东、广西、福建、台湾、海南等地。桃金娘的根、叶和果均可入药，是一种重要的药用野生植物资源，具有较高的开发利用价值。
桃金娘果实为浆果，成熟时果皮呈紫黑色，果肉则呈紫红色，肉质多汁，营养丰富，具有良好的营养与保健功能。研究表明，桃金娘果实不仅富含人体所需的维生素、氨基酸、有机酸、矿物质、糖类等营养成分[1-3]，而且含有黄酮苷[4-5]、花色苷[6-9]以及植物多糖类[10]等生物活性物质。然而，有关桃金娘果实酚类物质的抗氧化活性的研究尚未见报道。本文以去除种子后的桃金娘果实为材料，采用水与体积分数80%甲醇为溶剂获得提取物，研究了2种提取物的总酚和总黄酮含量及其抗氧化活性的差异，旨在为开发和利用桃金娘果实这一传统的营养保健食品资源提供理论指导和实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试桃金娘果实：已成熟的桃金娘果实采自广东省湛江市中国热带农业科学院南亚热带作物研究所种质资源圃，将种子分离后，于-80 ℃冰箱中保存备用。
主要仪器：紫外可见分光光度计UV-1200，上海美谱达仪器有限公司；电子分析天平ML204，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；高速冷冻离心机Heraeus Multifuge X1R，德国Thermo Fisher Scientific公司。
主要试剂：Folin-Cioealteu试剂、没食子酸、芦丁、Trolox（水溶性维生素E类似物）、DPPH、ABTS、TPTZ，均购自美国Sigma-Aldrich公司。 1.2 方法
1.2.1 提取物制备 将桃金娘果实去除种子后，于研钵中加液氮研磨成干粉状，准确称量2.0 g样品至50 mL离心管中，加入20 mL提取溶剂（蒸馏水或80%甲醇），80 ℃水浴中提取30 min后，于4 ℃下离心（2 200×g）15 min，取上清液。沉淀物再用20 mL提取溶剂重复提取一次，合并2次的上清液，定容至40 mL，即为等体积的水提取物和80%甲醇提取物。
1.2.2 总酚含量测定 总酚含量参照福林酚法[11]进行测定，以没食子酸标准品制作标准曲线。将0.5 mL提取物与2.5 mL 10% 的福林酚试剂混匀，黑暗中孵育5 min后，再加入2.0 mL 20%的Na2CO3，30 ℃水浴中避光反应1 h，于765 nm处测吸光值。
1.2.3 总黄酮含量测定 总黄酮含量测定参照Benamar[12]的方法，以芦丁标准品制作标准曲线。将0.5 mL提取物与0.5 mL 5%的NaNO2溶液混匀，反应5 min后加入0.5 mL 10% 的AlCl3，静置6 min后，再加入1.5 mL 1.0 mol/L NaOH，40 ℃水浴中避光孵育15 min，于510 nm处测吸光值。
1.2.4 抗氧化活性测定 DPPH自由基清除能力：参照Vieira等[13]的方法，稍加改动。取2.9 mL现配的DPPH溶液，于517 nm下测定初始吸光值（t0），再加入0.1 mL提取物，于30 ℃水浴中避光反应15 min后，立即测定其吸光值（t15）。样品的DPPH自由基清除率（%）按[100 -（t15/t0）×100]计算，用Trolox为标准物制作标准曲线计算其抗氧化活性（mmol TE/g FW）。
ABTS自由基清除能力：参照Re等[14]的方法，略作修改。将现配的ABTS反应液用80%乙醇稀释至734 nm处的吸光值为0.70±0.02，作为初始吸光值（t0）。取0.1 mL提取物与2.9 mL稀释了的ABTS反应液混匀，30 ℃水浴中避光反应7 min后，立即测定其吸光值（t7）。样品的ABTS自由基清除率（%）按[100-（t7/t0）×100]计算，以Trolox为标准物制作标准曲线，其抗氧化活性表示为mmol TE/g FW。
FRAP总抗氧化能力：参照Benzie等[15]的方法，略加改动。取0.15 mL提取物与2.85 mL 现配的FRAP试剂混匀，37 ℃水浴中避光反应20 min后，于593 nm下测定其吸光值。以FeSO4为标准物制作标准曲线计算其总抗氧化能力，单位表示为Mmol FeSO4/g FW。
1.3 统计分析
所有试验结果数据均以3个重复测定值的平均值±标准差表示，并运用SPSS 10.0统计分析软件按方差分析（ANOVA）进行数据统计，各处理组间的差异比较用LSD法检验，p<0.05有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 桃金娘果实不同提取物的总酚和总黄酮含量
以等体积的水和体积分数80%甲醇为提取溶剂，测得从桃金娘果实中提取得到的总酚（没食子酸等效物）和总黄酮（芦丁等效物）含量见表1。表1结果表明，体积分数80%甲醇提取物的总酚和总黄酮含量均显著高于水提取物（p<0.05），分别是后者的2.26倍和1.95倍，说明体积分数80%甲醇溶剂的提取效果好。
2.2 桃金娘果实不同提取物的抗氧化活性
2.2.1 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基是一种很稳定的以氮为中心的有机自由基，其醇溶液为特征的紫色团吸收峰，具有孤对电子，能够与抗氧化剂提供的电子配对结合，使DPPH的特征紫色变浅，因此可用于抗氧化剂清除自由基能力的评价。本研究中，以标准抗氧化剂Trolox为等效物的桃金娘果实2种溶剂提取物的DPPH自由基清除能力如表2所示。表2表明，体积分数80%甲醇提取物的DPPH自由基清除能力显著高于水提取物（p<0.05），是后者的1.52倍。
2.2.2 ABTS自由基清除能力 ABTS经氧化后生成相对稳定的蓝绿色的ABTS+水溶性自由基。抗氧化剂与ABTS自由基反应后使其溶液褪色，特征吸光值降低。溶液褪色越明显，则表明所检测物质的总抗氧化能力越强。本研究以Trolox为标准计算桃金娘果实2种溶剂提取物的ABTS自由基清除能力，结果见表2。表2表明，体积分数80%甲醇提取物的ABTS自由基清除能力显著高于水提取物（p<0.05），是后者的1.40倍。
2.2.3 总抗氧化能力 FRAP法是一种快速简便、易于操作、重复性好的测定总抗氧化能力的方法。在一定条件下，待测生物活性物质将Fe3+还原为Fe2+的能力越大，其抗氧化活性越强。本研究是以Fe2+当量计算桃金娘果实不同提取物的总抗氧化能力，结果见表2。表2表明，体积分数80%甲醇提取物的总抗氧化能力显著高于水提取物（p<0.05），是后者的1.51倍。
3 讨论与结论
活性氧代谢失调是自由基大量产生的主要途径。自由基生物学研究认为，许多疾病的发生与自由基导致的大分子功能障碍如蛋白质修饰、脂质过氧化以及DNA损伤等有关[16]。植物多酚类物质是天然的抗氧化剂，具有抗氧化、抑菌、抗致突变、抗衰老、抗炎症等活性[17]。摄取天然抗氧化剂可有效地协助维持体内自由基代谢的平衡，减少或防止相关疾病的发生[18]。Geetha等[19-20]研究了桃金娘叶片的抗氧化活性，发现桃金娘叶片的乙醇提取物具有较强的抗氧化活性。从本实验结果可以看出，桃金娘果实提取物中含有较高的总酚与总黄酮含量，含量分别达到1.74～3.94 mg GaA/g FW与1.14～2.22 mg RU/g FW，说明桃金娘果实提取物含有较为丰富的多酚类化合物，并且对DPPH与ABTS自由基具有较好的清除效果，分别达到26.66～40.40 μmol TE/g FW与32.57～45.76 μmol TE/g FW，同时通过总抗氧化能力的测试，均能表明桃金娘果实提取物具有较好的抗氧化活性。然而，对于桃金娘果实提取物中的活性成分及其作用机理，还有待于进一步研究。 不同溶剂制备的提取物，其抗氧化活性显著不同，这主要是与提取剂的极性有关[21]。不同溶剂对桃金娘果实中抗氧化物质的溶解能力不同，所获得的提取物中总酚和总黄酮含量显著不同，以致不同溶剂提取物的清除DPPH和ABTS自由基能力以及总抗氧化能力的差异显著。本研究结果表明，以体积分数80%甲醇为提取溶剂获得的桃金娘果实提取物在总酚与总黄酮含量以及清除DPPH和ABTS自由基能力、总抗氧化能力等方面均显著高于以水为提取溶剂获得的提取物，说明体积分数80%甲醇比水能更好地从桃金娘果实中获取抗氧化物质。此外，桃金娘果实提取物的抗氧化活性高低与其所含的酚类物质含量有关，至于相关的显著性如何，还有待于进一步测试。
参考文献
[1] 刘 芳， 敖常伟， 邓毓芳， 等. 桃金娘果酒的研制[J]. 广西林业科学， 1997， 26（3）： 119-122.
[2] 吴文珊， 方玉霖， 张清其. 桃金娘Rhodomyrtus tomcntosa果实的营养成分研究[J]. 武夷科学， 1998（12）： 226-228.
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[8] 钟海雁. 山稔红天然食用色素开发利用的研究[J]. 林业科技开发， 1994（4）： 25-26
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[10] 秦小明， 隋亚君， 宁恩创. 桃金娘果实多糖的构造研究[J]. 食品科学， 2005， 26（4）： 79-82.
[11] Singleton V L， Orthofer R， Lamuela-Raventós R M. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent[J]. Methods in enzymology， 1999（299）： 152-178.
[12] Benamar H， Rached W， Derdour A， et al. Screening of algerian medicinal plants for acetylcholinesterase inhibitory activity[J]. Journal of Biological Sciences， 2010， 10（1）： 1-9.
[13] Vieira F G K， Borges G S C， Copetti C， et al. Phenolic compounds and antioxidant activity of the apple flesh and peel of eleven cultivars grown in Brazil[J]. Scientia Horticulturae，2011， 128（3）： 261-266.
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[16] 张桂芝， 耿 莎， 杨海燕， 等. 植物抗氧化成分的研究进展[J]. 食品科学， 2007， 28（12）： 551-553.
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[21] 陈 林， 吴 青， 韦 薇， 等.大叶紫薇叶提取物抗氧化性能的研究[J]. 食品与发酵工业， 2006， 32（3）： 47-50.
责任编辑：黄 艳
关键词 桃金娘果实；多酚；抗氧化活性；清除自由基
中图分类号 S667.9 文献标识码 A
Antioxidant Activity of Rhodomyrtus tomentosa Fruit Extracts
YANG Weihai1，2， LIU Suifei3， ZOU Minghong1，2， ZENG Hui1，2，
ZHANG Hanzhou1，2， LU Chaozhong1，2*
1 South Subtropical Crops Research Institute， CATAS， Zhanjiang， Guangdong 524091， China
2 Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture， Zhanjiang， Guangdong 524091， China
3 Jiang Xi Agricultural Engineering College， Zhangshu， Jiangxi 331200， China
Abstract The contents of the total phenolics and total flavonoids from the extracts of Rhodomyrtus tomentosa fruit without seeds were extracted with the same volume solvents water and 80% methanol and quantified. The antioxidant activities of the two extracts were screened using the total antioxidant capacity and the scavenging activities of DPPH and ABTS radicals. The results showed that both extracts of R. tomentosa fruit exhibited varying degrees of the polyphenol content and the antioxidant activity， the extractives from the 80% methanol exhibited significant higher contents of total phenolics， total flavonoids， stronger total antioxidant capacity and radical scavenging abilities on DPPH and ABTS than that from water. The results revealed that the polyphenol extractives from R. tomentosa fruit had good antioxidant activity.
Key words Rhodomyrtus tomentosa fruit；Polyphenols；Antioxidant activity；Radical scavenging
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.020
桃金娘[Rhodomyrtus tomentosa（Ait.）Hassk]，又称桃娘、岗稔、山稔、稔子、豆稔等，系桃金娘科（Myrtaceae）桃金娘属（Rhodomyrtus）常绿小灌木，主要分布于中国广东、广西、福建、台湾、海南等地。桃金娘的根、叶和果均可入药，是一种重要的药用野生植物资源，具有较高的开发利用价值。
桃金娘果实为浆果，成熟时果皮呈紫黑色，果肉则呈紫红色，肉质多汁，营养丰富，具有良好的营养与保健功能。研究表明，桃金娘果实不仅富含人体所需的维生素、氨基酸、有机酸、矿物质、糖类等营养成分[1-3]，而且含有黄酮苷[4-5]、花色苷[6-9]以及植物多糖类[10]等生物活性物质。然而，有关桃金娘果实酚类物质的抗氧化活性的研究尚未见报道。本文以去除种子后的桃金娘果实为材料，采用水与体积分数80%甲醇为溶剂获得提取物，研究了2种提取物的总酚和总黄酮含量及其抗氧化活性的差异，旨在为开发和利用桃金娘果实这一传统的营养保健食品资源提供理论指导和实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试桃金娘果实：已成熟的桃金娘果实采自广东省湛江市中国热带农业科学院南亚热带作物研究所种质资源圃，将种子分离后，于-80 ℃冰箱中保存备用。
主要仪器：紫外可见分光光度计UV-1200，上海美谱达仪器有限公司；电子分析天平ML204，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；高速冷冻离心机Heraeus Multifuge X1R，德国Thermo Fisher Scientific公司。
主要试剂：Folin-Cioealteu试剂、没食子酸、芦丁、Trolox（水溶性维生素E类似物）、DPPH、ABTS、TPTZ，均购自美国Sigma-Aldrich公司。 1.2 方法
1.2.1 提取物制备 将桃金娘果实去除种子后，于研钵中加液氮研磨成干粉状，准确称量2.0 g样品至50 mL离心管中，加入20 mL提取溶剂（蒸馏水或80%甲醇），80 ℃水浴中提取30 min后，于4 ℃下离心（2 200×g）15 min，取上清液。沉淀物再用20 mL提取溶剂重复提取一次，合并2次的上清液，定容至40 mL，即为等体积的水提取物和80%甲醇提取物。
1.2.2 总酚含量测定 总酚含量参照福林酚法[11]进行测定，以没食子酸标准品制作标准曲线。将0.5 mL提取物与2.5 mL 10% 的福林酚试剂混匀，黑暗中孵育5 min后，再加入2.0 mL 20%的Na2CO3，30 ℃水浴中避光反应1 h，于765 nm处测吸光值。
1.2.3 总黄酮含量测定 总黄酮含量测定参照Benamar[12]的方法，以芦丁标准品制作标准曲线。将0.5 mL提取物与0.5 mL 5%的NaNO2溶液混匀，反应5 min后加入0.5 mL 10% 的AlCl3，静置6 min后，再加入1.5 mL 1.0 mol/L NaOH，40 ℃水浴中避光孵育15 min，于510 nm处测吸光值。
1.2.4 抗氧化活性测定 DPPH自由基清除能力：参照Vieira等[13]的方法，稍加改动。取2.9 mL现配的DPPH溶液，于517 nm下测定初始吸光值（t0），再加入0.1 mL提取物，于30 ℃水浴中避光反应15 min后，立即测定其吸光值（t15）。样品的DPPH自由基清除率（%）按[100 -（t15/t0）×100]计算，用Trolox为标准物制作标准曲线计算其抗氧化活性（mmol TE/g FW）。
ABTS自由基清除能力：参照Re等[14]的方法，略作修改。将现配的ABTS反应液用80%乙醇稀释至734 nm处的吸光值为0.70±0.02，作为初始吸光值（t0）。取0.1 mL提取物与2.9 mL稀释了的ABTS反应液混匀，30 ℃水浴中避光反应7 min后，立即测定其吸光值（t7）。样品的ABTS自由基清除率（%）按[100-（t7/t0）×100]计算，以Trolox为标准物制作标准曲线，其抗氧化活性表示为mmol TE/g FW。
FRAP总抗氧化能力：参照Benzie等[15]的方法，略加改动。取0.15 mL提取物与2.85 mL 现配的FRAP试剂混匀，37 ℃水浴中避光反应20 min后，于593 nm下测定其吸光值。以FeSO4为标准物制作标准曲线计算其总抗氧化能力，单位表示为Mmol FeSO4/g FW。
1.3 统计分析
所有试验结果数据均以3个重复测定值的平均值±标准差表示，并运用SPSS 10.0统计分析软件按方差分析（ANOVA）进行数据统计，各处理组间的差异比较用LSD法检验，p<0.05有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 桃金娘果实不同提取物的总酚和总黄酮含量
以等体积的水和体积分数80%甲醇为提取溶剂，测得从桃金娘果实中提取得到的总酚（没食子酸等效物）和总黄酮（芦丁等效物）含量见表1。表1结果表明，体积分数80%甲醇提取物的总酚和总黄酮含量均显著高于水提取物（p<0.05），分别是后者的2.26倍和1.95倍，说明体积分数80%甲醇溶剂的提取效果好。
2.2 桃金娘果实不同提取物的抗氧化活性
2.2.1 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基是一种很稳定的以氮为中心的有机自由基，其醇溶液为特征的紫色团吸收峰，具有孤对电子，能够与抗氧化剂提供的电子配对结合，使DPPH的特征紫色变浅，因此可用于抗氧化剂清除自由基能力的评价。本研究中，以标准抗氧化剂Trolox为等效物的桃金娘果实2种溶剂提取物的DPPH自由基清除能力如表2所示。表2表明，体积分数80%甲醇提取物的DPPH自由基清除能力显著高于水提取物（p<0.05），是后者的1.52倍。
2.2.2 ABTS自由基清除能力 ABTS经氧化后生成相对稳定的蓝绿色的ABTS+水溶性自由基。抗氧化剂与ABTS自由基反应后使其溶液褪色，特征吸光值降低。溶液褪色越明显，则表明所检测物质的总抗氧化能力越强。本研究以Trolox为标准计算桃金娘果实2种溶剂提取物的ABTS自由基清除能力，结果见表2。表2表明，体积分数80%甲醇提取物的ABTS自由基清除能力显著高于水提取物（p<0.05），是后者的1.40倍。
2.2.3 总抗氧化能力 FRAP法是一种快速简便、易于操作、重复性好的测定总抗氧化能力的方法。在一定条件下，待测生物活性物质将Fe3+还原为Fe2+的能力越大，其抗氧化活性越强。本研究是以Fe2+当量计算桃金娘果实不同提取物的总抗氧化能力，结果见表2。表2表明，体积分数80%甲醇提取物的总抗氧化能力显著高于水提取物（p<0.05），是后者的1.51倍。
3 讨论与结论
活性氧代谢失调是自由基大量产生的主要途径。自由基生物学研究认为，许多疾病的发生与自由基导致的大分子功能障碍如蛋白质修饰、脂质过氧化以及DNA损伤等有关[16]。植物多酚类物质是天然的抗氧化剂，具有抗氧化、抑菌、抗致突变、抗衰老、抗炎症等活性[17]。摄取天然抗氧化剂可有效地协助维持体内自由基代谢的平衡，减少或防止相关疾病的发生[18]。Geetha等[19-20]研究了桃金娘叶片的抗氧化活性，发现桃金娘叶片的乙醇提取物具有较强的抗氧化活性。从本实验结果可以看出，桃金娘果实提取物中含有较高的总酚与总黄酮含量，含量分别达到1.74～3.94 mg GaA/g FW与1.14～2.22 mg RU/g FW，说明桃金娘果实提取物含有较为丰富的多酚类化合物，并且对DPPH与ABTS自由基具有较好的清除效果，分别达到26.66～40.40 μmol TE/g FW与32.57～45.76 μmol TE/g FW，同时通过总抗氧化能力的测试，均能表明桃金娘果实提取物具有较好的抗氧化活性。然而，对于桃金娘果实提取物中的活性成分及其作用机理，还有待于进一步研究。 不同溶剂制备的提取物，其抗氧化活性显著不同，这主要是与提取剂的极性有关[21]。不同溶剂对桃金娘果实中抗氧化物质的溶解能力不同，所获得的提取物中总酚和总黄酮含量显著不同，以致不同溶剂提取物的清除DPPH和ABTS自由基能力以及总抗氧化能力的差异显著。本研究结果表明，以体积分数80%甲醇为提取溶剂获得的桃金娘果实提取物在总酚与总黄酮含量以及清除DPPH和ABTS自由基能力、总抗氧化能力等方面均显著高于以水为提取溶剂获得的提取物，说明体积分数80%甲醇比水能更好地从桃金娘果实中获取抗氧化物质。此外，桃金娘果实提取物的抗氧化活性高低与其所含的酚类物质含量有关，至于相关的显著性如何，还有待于进一步测试。
参考文献
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责任编辑：黄 艳