采用MA104细胞系培养和T载体克隆技术,在轮状病毒结构蛋白VP4基因序列中设计合成引物,经过PCR扩增后将特异性产物与pMD-19-T载体连接,对获得的轮状病毒重组质粒标准品进行酶切鉴定和测序分析。利用常规PCR和荧光定量PCR方法对获得的重组质粒标准品进行特异性和灵敏度指标的检验。结果表明,将构建的重组质粒作为标准品制备标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系(斜率为-4.015,R2=0.991);荧光定量PCR熔解曲线分析表明,85.8℃的PCR产物是轮状病毒VP4基因序列的特异性产物,该标准品具有轮状病毒特异性;同时,所制备的重组质粒标准品在荧光定量PCR检测中具有较大的线性范围(5×101~5×1010拷贝/μL),每个梯度PCR反应最低可以检测到50拷贝的重组质粒,因而采用该标准品进行荧光定量PCR分析具有较高的检测灵敏度;此外,该重组质粒标准品具有较高的稳定性和重复性,3次独立实验的变异因数Cv<1.5%。构建的重组质粒标准品可以用做环境水体中轮状病毒的荧光定量PCR标准品。