【摘 要】
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目的 构建环状RNA mmu＿circ＿0001033慢病毒表达载体，作为在低氧性肺动脉高压功能学实验研究的基础。方法 首先设计引物将目的基因片段从原质粒上扩增下来，通过引物两端所含无缝克隆识别位点将其重组到酶切后的过表达载体上;将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，而后将其单克隆菌落送测序公司进行测序鉴定。其次通过PCR产物跑胶和测序验证成环情况。最后用构建的重组表达载体和包装质粒共同转染293
【机 构】
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陆军(第三)军医大学第二附属医院老年与特勤医学科
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（81870044,81873421）； 高校基础研究课题（2020-2017-075）；
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目的 构建环状RNA mmu＿circ＿0001033慢病毒表达载体，作为在低氧性肺动脉高压功能学实验研究的基础。方法 首先设计引物将目的基因片段从原质粒上扩增下来，通过引物两端所含无缝克隆识别位点将其重组到酶切后的过表达载体上;将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，而后将其单克隆菌落送测序公司进行测序鉴定。其次通过PCR产物跑胶和测序验证成环情况。最后用构建的重组表达载体和包装质粒共同转染293T细胞，包装慢病毒，收集病毒原液，超滤浓缩，并测定滴度。结果经过比对，重组克隆中插入片段序列与目的片段序列完全一致，表明质粒构建成功。PCR产物后经sanger测序确认环化位点处序列完全正确。将构建的过表达载体测序结果和质粒构建方案基因比对，重组克隆中插入片段序列与目的片段序列与预期完全一致，可实现转染质粒后目的基因的表达，PCR产物跑胶和测序结果表明mmu＿circ＿0001033成环成功。PCR产物跑胶和测序结果表明mmu＿circ＿0001033成环成功。最后通过比较RT-qPCR测定病毒滴度值为2.09×10~8TU/ml。结论 成功构建环状RNA mmu＿circ＿0001033慢病毒表达载体，能稳定转染293T细胞，可用于后续细胞实验。
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