论文部分内容阅读
目的
确定肽核酸钳制-PCR(PNA-PCR)检测K-ras突变的阳性判断阈值(Cut off)和检测下限。
方法将含K-ras基因12或13密码子突变的胰腺癌细胞株PANC1、SW1990基因组DNA以不同的浓度分别与K-ras野生型的胎盘DNA混合配制成含不同突变率(0、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.1%、6.25%、12.5%、25%、50%)的样本，并制备1%突变率PANC1细胞及30%突变率SW1990细胞DNA总量分别为50、20、5、1 ng和50、10、5、1 ng的样本。应用PNA-PCR方法检测样本中的K-ras基因12、13密码子突变，收集它们的突变Ct值、总体Ct值，并计算出ΔCt值(突变Ct值–总体Ct值)。实验重复10次。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析ΔCt值，确定K-ras基因突变的最适Cut off值，计算诊断阳性率及确定诊断下限。
结果所有不同突变率的PANC1细胞12密码子突变以及SW1990细胞13密码子突变的突变Ct值及ΔCt值与阴性对照样本的差异均有统计学意义(P值均<0.05)，而总体Ct值与阴性对照样本的差异无统计学意义。诊断K-ras基因12密码子突变的ROC曲线下面积(AUC)为0.926，最适Cut off值为11，相应的敏感度和特异度为84%和100%，检出下限为0.4 ng；诊断K-ras基因13密码子突变的AUC为0.906，最适Cut off值为9.5，相应的敏感度和特异度为71%和100%，检测下限为1.5 ng。固定突变率的检测结果进一步确定上述的检测下限。
结论成功确立了PNA-PCR法检测K-ras基因12、13密码子突变的Cut off值和检测下限，达到临床应用的要求。