【摘 要】
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根据已报道的柔嫩艾美耳球虫3-1E基因序列设计引物,以孢子化卵囊总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增得到1条特异片段,将扩增产物克隆至pMD-18T载体,转化感受态菌JM109,经酶切鉴定
【机 构】
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海南省农业科学院畜牧兽医研究所,海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室
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根据已报道的柔嫩艾美耳球虫3-1E基因序列设计引物,以孢子化卵囊总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增得到1条特异片段,将扩增产物克隆至pMD-18T载体,转化感受态菌JM109,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序.测序结果与已发表的国内外相关虫株的3-1E基因序列比较,核苷酸的同源性均在99.2％～ 99.8％,氨基酸的同源性均在98.2％ ～ 100％.然后将重组质粒和表达载体pGEX-4T-1分别用XhoⅠ和EcoR Ⅰ酶切后构建重组表达载体pGEX-3-1E,并将其转化入大肠杆菌BL21中,提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后,用IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测显示,3-1E基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白的分子量为44.7 ku,诱导表达5h的蛋白表达量可达到30％以上.
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