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摘 要：为了研究MYH10在猪不同类型肌肉中的表达变化趋势，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time Polymerase Chain Reaction，Real-time PCR）技术检测了3个发育日龄的大白猪和山西黑猪三种肌肉组织中MYH10基因的表达变化。结果表明，MYH10基因在两个品种的背最长肌和腰大肌中的表达存在相似的变化趋势。在25日龄的背最长肌和腰大肌中的表达量最高，在70 d时表达量降到最低水平，而后背最长肌表达量逐渐升高，但腰大肌的表达量仍然保持在低水平。两个品种不同组织间的表达结果相似，在25 d和70 d时MYH10在腰大肌中表达极显著高于背最长肌和股二头肌（P<0.01），而在发育后期背最长肌和股二头肌中的表达量逐渐升高，150 d时极显著高于腰大肌的表达量（P<0.01）。本研究的結果充分说明，MYH10在肌纤维发育与分化过程中具有重要的调节作用。
关键词：山西猪；大白猪；MYH10；发育性表达
中图分类号：S831 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2018）05-0030-04
哺乳动物的肌肉组织大约占该动物机体组织的50%，它不但是主要的运动器官，而且是家养动物重要的经济性状[1]。肌球蛋白在肌肉的生长发育、运动收缩过程起重要作用。肌原纤维由粗丝和细丝组成，其中肌纤维粗丝的主要成分为肌球蛋白，在不同物种中肌球蛋白的基本结构是一致的，都是由两条肌球蛋白重链和四条肌球蛋白轻链构成[2-4]。其中肌球蛋白轻链作为结构和调节蛋白在肌纤维发生分化、肌肉运动和代谢等过程中发挥重要生理功能。肌球蛋白重链是骨骼肌收缩蛋白的重要组成成分，其主要功能是参与肌肉收缩功能[5-6]。雷蒙特等揭示了它的三维结构，发现在肌球蛋白的头部含有肌动蛋白和核苷酸的结合位点，具有三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）酶活性，通过ATP水解，将化学能转化为机械能，产生肌肉收缩[2，7]。
肌球蛋白10（Myosin-10）基因也称为MYH10，为肌球蛋白超家族中的一员，是一种在脊椎动物中表达的非传统肌球蛋白，它参与细胞增殖、黏附、迁移及吞噬等运动行为，是通过与微丝、微管相互作用来调控的[8-11]。MYH10存在于肌细胞，具有收缩功能，在非肌细胞中的功能也与肌球蛋白有关[12]。
新山西黑猪是在原山西黑猪（血源为马身猪、内江猪和巴克夏猪）与杜洛克猪进行杂交选育而成的品种，具有产仔数高、肉品质好、抗逆性强等优点[13]。本研究将山西黑猪和大白猪作为对照的动物模型，选择25日龄、70日龄和150日龄三个不同生长阶段，采用实时定量PCR技术对MYH10基因在两个品种中的时序性表达变化趋势以及表达差异进行分析，为研究猪肌肉发育的分子机理提供理论参考。
1 试验材料与方法
1.1 试验样本采集
本试验的试验动物为大白猪和山西黑猪，饲养于山西省乡宁县永新康生态养殖有限公司，同期组建试验猪群，饲养管理条件相同。在两个品种仔猪的25 d、70 d和150 d分别屠宰3头，共18头，屠宰后取背最长肌、腰大肌、股二头肌等组织，用焦碳酸二乙酯水洗去表面血液，立即投入液氮，后在-80 ℃冰箱保存备用。
1.2 试剂与耗材
Trizol为美国Invitrogen公司产品；PrimeScriptTMRT Reagent kit with gDNA Eraser、SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit购买于大连宝生物工程有限公司；乙醇、异丙醇等常规生化试剂均为分析纯。
1.3 总RNA的提取与cDNA第一条链的合成
总RNA的提取按照Trizol（Invitrogen）试剂手册进行操作，取2 μL提取的RNA于ND1000核酸蛋白测定仪测定纯度及浓度，要求OD260/280值在1.9～2.1之间。反转录按照gDNA Eraser反转录（TaKaRa）说明书进行。
1.4 引物设计与合成
参考NCBI数据库中猪MYH10的序列信息，以18S为内参基因，选用Primer Premier 5.0结合Oligo 6.0软件进行引物设计，引物序列信息见表1。引物委托上海生物工程有限公司合成。
1.5 实时荧光定量PCR反应体系及反应条件优化
根据SYBR?PrimeScriptTM RT-PCR Kit试剂盒说明书建议的反应条件，以反转录合成的第一链cDNA进行常规梯度PCR扩增，分别筛选内标基因和目的基因引物的最佳退火温度、cDNA模板浓度，确定引物退火温度后，进行Real-time PCR检测相应引物扩增熔解曲线、目的基因和内标基因的扩增效率。
1.6 标准曲线的制作
由反转录合成的第一链cDNA为模板，5倍稀释5个浓度梯度，根据筛选优化结果，进行Real-time PCR反应，建立标准曲线。
借助MXPro-MX3000P软件（Stratagene公司）分析导出内标基因和目的基因标准曲线方程、扩增效率R2以及直线方程系数，并分析各基因之间的扩增效率。用优化确定的反应体系及反应条件进行目的基因的相对定量分析。
1.7 数据处理
Real-time PCR结果应用MXPro-MX3000P软件（Stratagene公司）导出。采用-△△Ct方法获得目的基因的相对表达量。用SPSS 22.0软件对同一品种不同时间点或不同组织进行单因素方差分析，并用邓肯氏法进行多重比较；用独立样本t检验分析两个品种间同一基因的表达差异。采用GraphPad Prism 5进行图表的绘制与输出。
2 结果与分析
2.1 RNA样本浓度与纯度的检测结果 用核酸蛋白测定仪测定各样本RNA的浓度及纯度，根据所测结果计算反转录时所需的RNA量。经过检测，所有样本RNA的OD260/280值都在1.9～ 2.1之间，浓度在311 ng/μL～3 183 ng/μL。质量良好，可以进行后续试验。
2.2 实时荧光定量PCR扩增动力学曲线
本试验以18S rRNA为内参基因，内参基因和目的基因扩增曲线拐点清楚，基线平直，曲线良好。试验样本的扩增溶解曲线见圖1。18S和MYH10基因的扩增产物的Tm值都为单峰值，表明扩增过程中没有二聚体生成，扩增效果较好。
2.3 不同时期MYH10 mRNA的表达检测结果
图2是MYH10基因在大白猪和山西黑猪三个时间点的表达趋势检测结果。以25日龄大白猪腰大肌中MYH10的表达值作为对照。图2-A是背最长肌中的表达检测结果。从结果可知，MYH10基因在两个品种中都具有先降低后升高的表达趋势。MYH10基因在25 d和150 d表达量极显著高于70 d的表达量（P<0.01）。在三个采样点对两个品种间的表达量进行比较发现，25 d和70 d大白猪的表达量极显著高于山西黑猪（P<0.01），而150 d时大白猪和山西黑猪的背最长肌中的表达量无显著差异（P>0.05）。
MYH10基因在腰大肌中的表达检测结果见图2-B。经分析发现，大白猪和山西黑猪腰大肌中MYH10基因在前期表达较高，随着日龄的不断增加，表达量出现极显著的下降（P<0.01）。大白猪中，25 d腰大肌MYH10的表达水平极显著高于70 d和150 d，而70 d和150 d的表达量差异不显著（P>0.05）。在山西黑猪中，25 d和70 d腰大肌中MYH10的表达量不存在差异，但极显著高于150 d的表达量。
与背最长肌和腰大肌相比，股二头肌中MYH10的表达并没有发生显著的时序性变化，结果见图2-C。25 d和150 d大白猪和山西黑猪MYH10表达差异显著（P<0.05），而70 d的大白猪和山西黑猪表达无显著差异（P>0.05）。
两个品种不同组织间的表达结果相类似，在发育前期（25 d）MYH10在腰大肌中表达极显著高于背最长肌和股二头肌（P<0.01），而在发育后期背最长肌和股二头肌中的表达量逐渐升高，150 d时极显著高于腰大肌中的表达量（图3）。
3 讨论
仔猪出生至断奶一段时间内，运动量比较小，肌肉主要由Ⅰ型肌纤维组成，随后逐渐被Ⅱ型肌纤维取代，其中随着日龄的增加，Ⅰ型肌纤维显著下降，Ⅱb型肌纤维显著升高，Ⅱa和Ⅱx型肌纤维先降低再升高[14-15]。胡帅帅等[16]研究得出在家兔中MYH6基因与肌纤维发育相关。在本次试验中两个品种的背最长肌和腰大肌中MYH10基因在断奶时（25日龄）的表达量高于在其他日龄时的表达量，而后随着生长发育，表达量逐渐降低，在保育期结束时（70日龄）降到最低水平，而后背最长肌表达量逐渐升高，但腰大肌的表达量仍然保持在低水平，可能是由于这三种肌肉的肌纤维类型发育不同造成的，说明MYH10在肌纤维发育与分化过程中具有重要的调节作用。
4 结论
通过对大白猪和山西黑猪不同日龄不同组织中MYH10基因mRNA发育性表达的检测，MYH10对不同肌肉中肌纤维的类型存在重要的调节作用，本研究结果可为深入研究肌纤维的发育提供理论参考。
参考文献：（16篇，略）
关键词：山西猪；大白猪；MYH10；发育性表达
中图分类号：S831 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2018）05-0030-04
哺乳动物的肌肉组织大约占该动物机体组织的50%，它不但是主要的运动器官，而且是家养动物重要的经济性状[1]。肌球蛋白在肌肉的生长发育、运动收缩过程起重要作用。肌原纤维由粗丝和细丝组成，其中肌纤维粗丝的主要成分为肌球蛋白，在不同物种中肌球蛋白的基本结构是一致的，都是由两条肌球蛋白重链和四条肌球蛋白轻链构成[2-4]。其中肌球蛋白轻链作为结构和调节蛋白在肌纤维发生分化、肌肉运动和代谢等过程中发挥重要生理功能。肌球蛋白重链是骨骼肌收缩蛋白的重要组成成分，其主要功能是参与肌肉收缩功能[5-6]。雷蒙特等揭示了它的三维结构，发现在肌球蛋白的头部含有肌动蛋白和核苷酸的结合位点，具有三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）酶活性，通过ATP水解，将化学能转化为机械能，产生肌肉收缩[2，7]。
肌球蛋白10（Myosin-10）基因也称为MYH10，为肌球蛋白超家族中的一员，是一种在脊椎动物中表达的非传统肌球蛋白，它参与细胞增殖、黏附、迁移及吞噬等运动行为，是通过与微丝、微管相互作用来调控的[8-11]。MYH10存在于肌细胞，具有收缩功能，在非肌细胞中的功能也与肌球蛋白有关[12]。
新山西黑猪是在原山西黑猪（血源为马身猪、内江猪和巴克夏猪）与杜洛克猪进行杂交选育而成的品种，具有产仔数高、肉品质好、抗逆性强等优点[13]。本研究将山西黑猪和大白猪作为对照的动物模型，选择25日龄、70日龄和150日龄三个不同生长阶段，采用实时定量PCR技术对MYH10基因在两个品种中的时序性表达变化趋势以及表达差异进行分析，为研究猪肌肉发育的分子机理提供理论参考。
1 试验材料与方法
1.1 试验样本采集
本试验的试验动物为大白猪和山西黑猪，饲养于山西省乡宁县永新康生态养殖有限公司，同期组建试验猪群，饲养管理条件相同。在两个品种仔猪的25 d、70 d和150 d分别屠宰3头，共18头，屠宰后取背最长肌、腰大肌、股二头肌等组织，用焦碳酸二乙酯水洗去表面血液，立即投入液氮，后在-80 ℃冰箱保存备用。
1.2 试剂与耗材
Trizol为美国Invitrogen公司产品；PrimeScriptTMRT Reagent kit with gDNA Eraser、SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit购买于大连宝生物工程有限公司；乙醇、异丙醇等常规生化试剂均为分析纯。
1.3 总RNA的提取与cDNA第一条链的合成
总RNA的提取按照Trizol（Invitrogen）试剂手册进行操作，取2 μL提取的RNA于ND1000核酸蛋白测定仪测定纯度及浓度，要求OD260/280值在1.9～2.1之间。反转录按照gDNA Eraser反转录（TaKaRa）说明书进行。
1.4 引物设计与合成
参考NCBI数据库中猪MYH10的序列信息，以18S为内参基因，选用Primer Premier 5.0结合Oligo 6.0软件进行引物设计，引物序列信息见表1。引物委托上海生物工程有限公司合成。
1.5 实时荧光定量PCR反应体系及反应条件优化
根据SYBR?PrimeScriptTM RT-PCR Kit试剂盒说明书建议的反应条件，以反转录合成的第一链cDNA进行常规梯度PCR扩增，分别筛选内标基因和目的基因引物的最佳退火温度、cDNA模板浓度，确定引物退火温度后，进行Real-time PCR检测相应引物扩增熔解曲线、目的基因和内标基因的扩增效率。
1.6 标准曲线的制作
由反转录合成的第一链cDNA为模板，5倍稀释5个浓度梯度，根据筛选优化结果，进行Real-time PCR反应，建立标准曲线。
借助MXPro-MX3000P软件（Stratagene公司）分析导出内标基因和目的基因标准曲线方程、扩增效率R2以及直线方程系数，并分析各基因之间的扩增效率。用优化确定的反应体系及反应条件进行目的基因的相对定量分析。
1.7 数据处理
Real-time PCR结果应用MXPro-MX3000P软件（Stratagene公司）导出。采用-△△Ct方法获得目的基因的相对表达量。用SPSS 22.0软件对同一品种不同时间点或不同组织进行单因素方差分析，并用邓肯氏法进行多重比较；用独立样本t检验分析两个品种间同一基因的表达差异。采用GraphPad Prism 5进行图表的绘制与输出。
2 结果与分析
2.1 RNA样本浓度与纯度的检测结果 用核酸蛋白测定仪测定各样本RNA的浓度及纯度，根据所测结果计算反转录时所需的RNA量。经过检测，所有样本RNA的OD260/280值都在1.9～ 2.1之间，浓度在311 ng/μL～3 183 ng/μL。质量良好，可以进行后续试验。
2.2 实时荧光定量PCR扩增动力学曲线
本试验以18S rRNA为内参基因，内参基因和目的基因扩增曲线拐点清楚，基线平直，曲线良好。试验样本的扩增溶解曲线见圖1。18S和MYH10基因的扩增产物的Tm值都为单峰值，表明扩增过程中没有二聚体生成，扩增效果较好。
2.3 不同时期MYH10 mRNA的表达检测结果
图2是MYH10基因在大白猪和山西黑猪三个时间点的表达趋势检测结果。以25日龄大白猪腰大肌中MYH10的表达值作为对照。图2-A是背最长肌中的表达检测结果。从结果可知，MYH10基因在两个品种中都具有先降低后升高的表达趋势。MYH10基因在25 d和150 d表达量极显著高于70 d的表达量（P<0.01）。在三个采样点对两个品种间的表达量进行比较发现，25 d和70 d大白猪的表达量极显著高于山西黑猪（P<0.01），而150 d时大白猪和山西黑猪的背最长肌中的表达量无显著差异（P>0.05）。
MYH10基因在腰大肌中的表达检测结果见图2-B。经分析发现，大白猪和山西黑猪腰大肌中MYH10基因在前期表达较高，随着日龄的不断增加，表达量出现极显著的下降（P<0.01）。大白猪中，25 d腰大肌MYH10的表达水平极显著高于70 d和150 d，而70 d和150 d的表达量差异不显著（P>0.05）。在山西黑猪中，25 d和70 d腰大肌中MYH10的表达量不存在差异，但极显著高于150 d的表达量。
与背最长肌和腰大肌相比，股二头肌中MYH10的表达并没有发生显著的时序性变化，结果见图2-C。25 d和150 d大白猪和山西黑猪MYH10表达差异显著（P<0.05），而70 d的大白猪和山西黑猪表达无显著差异（P>0.05）。
两个品种不同组织间的表达结果相类似，在发育前期（25 d）MYH10在腰大肌中表达极显著高于背最长肌和股二头肌（P<0.01），而在发育后期背最长肌和股二头肌中的表达量逐渐升高，150 d时极显著高于腰大肌中的表达量（图3）。
3 讨论
仔猪出生至断奶一段时间内，运动量比较小，肌肉主要由Ⅰ型肌纤维组成，随后逐渐被Ⅱ型肌纤维取代，其中随着日龄的增加，Ⅰ型肌纤维显著下降，Ⅱb型肌纤维显著升高，Ⅱa和Ⅱx型肌纤维先降低再升高[14-15]。胡帅帅等[16]研究得出在家兔中MYH6基因与肌纤维发育相关。在本次试验中两个品种的背最长肌和腰大肌中MYH10基因在断奶时（25日龄）的表达量高于在其他日龄时的表达量，而后随着生长发育，表达量逐渐降低，在保育期结束时（70日龄）降到最低水平，而后背最长肌表达量逐渐升高，但腰大肌的表达量仍然保持在低水平，可能是由于这三种肌肉的肌纤维类型发育不同造成的，说明MYH10在肌纤维发育与分化过程中具有重要的调节作用。
4 结论
通过对大白猪和山西黑猪不同日龄不同组织中MYH10基因mRNA发育性表达的检测，MYH10对不同肌肉中肌纤维的类型存在重要的调节作用，本研究结果可为深入研究肌纤维的发育提供理论参考。
参考文献：（16篇，略）