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（1.新疆维吾尔自治区分析测试研究院，新疆乌鲁木齐830000;2.乌鲁木齐市农产品质量安全检测中心，新疆乌鲁木齐830000;3.新疆工程学院，新疆乌鲁木齐830000）
摘要[目的]通过建立高效液相色谱法（HPLC）进行棉籽中游离棉酚的含量测定。[方法]样品用乙醇提取，用HPLC进行检测。液相条件为：AgilentSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）;流动相为甲醇∶0.1%磷酸=85∶15，检测波长235nm，柱温35℃，流速0.8mL/min，进样量10μL。[结果]游离棉酚在1.06～42.40μg/mL线性关系良好，精密度、稳定性、重复性的RSD<2%。对全疆20个棉籽进行含量测定，样品含量为25～4887mg/kg。[结论]该方法具有良好的稳定性、准确度、灵敏度和回收率，可以适用于棉籽中游离棉酚的含量测定。
关键词棉籽;棉酚;高效液相色谱法
中图分类号TS207文献标识码A
文章编号0517-6611（2019）01-0216-02
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.063
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
棉酚（gossypol），又称棉花毒素，是一种黄色多羟基双萘醛化合物，主要分布在锦葵科植物树棉、草棉或陆地棉根皮、成熟种子、茎秆中色素腺体中[1]。棉酚可分为左旋棉酚[（-）-棉酚]和右旋棉酚[（+）-棉酚]2种光学异构体。（+）-棉酚几乎无活性，而（-）-棉酚表现出更强的药用活性，如抗生育[2]、抗肿瘤[3]、抗病毒[4]和抗菌作用[5]。
新疆是我国棉花的主产区，未脱毒或脱毒未完全的棉籽饲料中含有棉酚，棉酚会在动物体内发生代谢或蓄积[6]。人们食用这类动物源性食品后，游离棉酚及其主要代谢产物（棉酚酮）可能会通过食物进入人体各组织，危害人体健康[7]。为了防止棉籽饼粕中棉酚对人的伤害，对其含量的测定显得尤为重要。目前，检测游离棉酚的方法主要有分光光度法[8]、薄层层析法[9]、高效液相色谱法[10]等。该研究采用高效液相色谱检测技术，建立了HPLC法测定棉籽中棉酚含量的定量分析方法，并对新疆近年来棉籽中棉酚含量进行测定和监控。
1材料与方法
1.1试材棉酚参照品（浓度为88.2%以上），甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为优级纯，乙醇、乙酸为分析纯，水为一级水。
1.2仪器Agilent1260高效液相色谱仪、万分之一电子天平、涡旋混匀器（IKA公司）、数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
1.3样品制备采摘棉花后，剥去棉皮，取出棉花，留下棉籽。对棉籽进行初步打碎，把棉籽壳取出进行再次粉碎，最后粉碎过200目筛子。
1.4试验方法
1.4.1标准溶液配制。称取棉酚标准品0.0060g，加甲醇超声溶解，待完全溶解后定容至25mL容量瓶中，摇匀备用，-20℃条件保存。棉酚标准浓度为212μg/mL。有效期为3个月。取不同体积上述标准溶液用甲醇稀释成不同浓度的溶液，备用。
1.4.2前处理的优化。提取溶剂为丙酮∶水=70∶30、甲醇、乙醇、乙腈。因丙酮属于易制毒试剂，在液相色谱图上有响应高的干扰峰;乙腈毒性大，且成本高;甲醇属于工业乙醇;而乙醇提取效率高、安全性較可靠、性价比较高，对于人体的危害较小。因此，最终选用乙醇为提取溶剂。
1.4.3最大吸收波长。对棉酚标准品在200～800nm条件下进行分光光度计全波扫描，最终确定最大吸收波长为235nm。
1.4.4色谱条件。Agilent1260高效液相色谱仪，紫外检测器;色谱柱：AgilentSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）;流动相为甲醇-0.1%磷酸=85∶15;流速0.8mL/min;检测波长为235nm;进样时间20min;柱温35℃;进样量10μL。
2结果与分析
2.1稳定性试验取浓度为8.48μg/mL棉酚标准溶液分别以2、4、6、8、10、12、16、20、24h连续进样9针。结果发现，峰面积分别为801、798、791、785、768、773、749、732、721，可见峰面积稳定，表明该方法稳定性良好。
2.2精密度试验取浓度为10μg/mL棉酚标准溶液连续进样6针，峰面积分别为890、894、888、890、890、885，通过峰面积计算RSD值为0.32%，表明该方法精密度良好。
2.3重复性试验取6份同一样品中棉酚含量进行检测，发现峰面积分别为411、421、420、417、421、423，计算峰面积的RSD值为1.0%，表明该方法重复性良好。
2.4回收率试验对空白样品进行高、中、低3个浓度回收率试验检测，结果发现（表1），棉酚回收率为85.7%～95.8%，回收率较好。
2.5校正曲线的绘制取浓度为21.20μg/mL的标准储备液0.05、0.20、0.40、0.50、1.00、2.00mL分别置于10mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀、备用。以标准液浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线（图1），通过计算得知回归方程为（r=0.999945），表明标准曲线在1.06～42.40μg/mL线性关系良好。
2.6样品测定称取已制备的棉酚样品0.2g（准确至
0.0001g），加入乙醇10mL，超声提取15min，3000r/min离
心5min，将上清液转移至25mL容量瓶中;加入乙醇5mL，超
声10min，离心，重复提取2次。将3次提取的上清液全部转移至25mL容量瓶中，定容，摇匀，避光备用。按“1.4.4”液相色谱条件进行测定，发现棉酚含量为25～4887mg/kg。 3结论与讨论
该研究建立了棉籽粕中游离棉酚的HPLC测定。样品用乙醇提取，用HPLC进行检测。液相条件为AgilentSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）;流动相为甲醇∶0.1%磷酸=85∶15，检测波长235nm，柱温35℃，流速0.8mL/min，进样量10μL。游离棉酚在1.06～42.40μg/mL线性关系良好，精密度、稳定性、重复性的RSD<2%。该方法具有良好的稳定性、准确度、灵敏度和回收率，可以适用于棉籽中游离棉酚的含量测定。
对全疆不同地区25个棉籽样品进行含量测定，由于棉花品种及产地的不同，棉酚含量为25～4887mg/kg。棉酚含量较高，存在潜在的隐患风险，棉籽需要进行脱毒处理后，才能安全使用。
参考文献
[1]沈峥.棉酚与“橡皮蛋”[J].化学教学，2009（12）：50-52.
[2]李梁，刘育晨，杨占君，等.低剂量醋酸棉酚联合十一酸睾丸酮、云氧孕烯和微量炔雌醇可逆抗雄性生育作用[J].解剖学杂志，2017，40（6）：659-664，669.
[3]陈黄鸿，吴勇.棉酚及其衍生物抗肿瘤机制的研究进展[J].医学综述，2017，23（19）：3769-3773.
[4]李玲，刘玉秀，汪清民.棉酚的结构衍生及构效关系研究进展[J].中国科技论文，2015，10（12）：1351-1357.
[5]刘慧，季灵艳，赵天伦，等.陆地棉色素腺體与不同棉酚旋光体含量之间的相关性研究[J].棉花学报，2017，29（5）：437-446.
[6]袁洁，任丽君，李东雨，等.UPLC-MS/MS法测定游离棉酚及其代谢产物棉酚酮在大鼠体内的组织分布[J].新疆医科大学学报，2017，40（11）：1458-1461.
[7]周卫东，郑文新，高维明，等.畜禽产品中游离棉酚风险评估研究进展[J].草食家畜，2014，35（5）：12-15.
[8]中华人民共和国技术监督局.饲料中游离棉酚的测定方法：GB/T13086—1991[S].北京：中国标准出版社，1991.
[9]沈静，阳胜，于红，等.高效薄层色谱法测定棉籽油中游离棉酚含量[J].光谱实验室，2011，28（1）：235-238.
[10]吴伟伟，许赣荣.HPLC法测定棉籽饼粕饲料中的游离棉酚[J].河北农业大学学报，2009，32（5）：105-107，118.
安徽农业科学，J.AnhuiAgric.Sci.2019，47（1）：218-220
摘要[目的]通过建立高效液相色谱法（HPLC）进行棉籽中游离棉酚的含量测定。[方法]样品用乙醇提取，用HPLC进行检测。液相条件为：AgilentSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）;流动相为甲醇∶0.1%磷酸=85∶15，检测波长235nm，柱温35℃，流速0.8mL/min，进样量10μL。[结果]游离棉酚在1.06～42.40μg/mL线性关系良好，精密度、稳定性、重复性的RSD<2%。对全疆20个棉籽进行含量测定，样品含量为25～4887mg/kg。[结论]该方法具有良好的稳定性、准确度、灵敏度和回收率，可以适用于棉籽中游离棉酚的含量测定。
关键词棉籽;棉酚;高效液相色谱法
中图分类号TS207文献标识码A
文章编号0517-6611（2019）01-0216-02
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.063
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
棉酚（gossypol），又称棉花毒素，是一种黄色多羟基双萘醛化合物，主要分布在锦葵科植物树棉、草棉或陆地棉根皮、成熟种子、茎秆中色素腺体中[1]。棉酚可分为左旋棉酚[（-）-棉酚]和右旋棉酚[（+）-棉酚]2种光学异构体。（+）-棉酚几乎无活性，而（-）-棉酚表现出更强的药用活性，如抗生育[2]、抗肿瘤[3]、抗病毒[4]和抗菌作用[5]。
新疆是我国棉花的主产区，未脱毒或脱毒未完全的棉籽饲料中含有棉酚，棉酚会在动物体内发生代谢或蓄积[6]。人们食用这类动物源性食品后，游离棉酚及其主要代谢产物（棉酚酮）可能会通过食物进入人体各组织，危害人体健康[7]。为了防止棉籽饼粕中棉酚对人的伤害，对其含量的测定显得尤为重要。目前，检测游离棉酚的方法主要有分光光度法[8]、薄层层析法[9]、高效液相色谱法[10]等。该研究采用高效液相色谱检测技术，建立了HPLC法测定棉籽中棉酚含量的定量分析方法，并对新疆近年来棉籽中棉酚含量进行测定和监控。
1材料与方法
1.1试材棉酚参照品（浓度为88.2%以上），甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为优级纯，乙醇、乙酸为分析纯，水为一级水。
1.2仪器Agilent1260高效液相色谱仪、万分之一电子天平、涡旋混匀器（IKA公司）、数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
1.3样品制备采摘棉花后，剥去棉皮，取出棉花，留下棉籽。对棉籽进行初步打碎，把棉籽壳取出进行再次粉碎，最后粉碎过200目筛子。
1.4试验方法
1.4.1标准溶液配制。称取棉酚标准品0.0060g，加甲醇超声溶解，待完全溶解后定容至25mL容量瓶中，摇匀备用，-20℃条件保存。棉酚标准浓度为212μg/mL。有效期为3个月。取不同体积上述标准溶液用甲醇稀释成不同浓度的溶液，备用。
1.4.2前处理的优化。提取溶剂为丙酮∶水=70∶30、甲醇、乙醇、乙腈。因丙酮属于易制毒试剂，在液相色谱图上有响应高的干扰峰;乙腈毒性大，且成本高;甲醇属于工业乙醇;而乙醇提取效率高、安全性較可靠、性价比较高，对于人体的危害较小。因此，最终选用乙醇为提取溶剂。
1.4.3最大吸收波长。对棉酚标准品在200～800nm条件下进行分光光度计全波扫描，最终确定最大吸收波长为235nm。
1.4.4色谱条件。Agilent1260高效液相色谱仪，紫外检测器;色谱柱：AgilentSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）;流动相为甲醇-0.1%磷酸=85∶15;流速0.8mL/min;检测波长为235nm;进样时间20min;柱温35℃;进样量10μL。
2结果与分析
2.1稳定性试验取浓度为8.48μg/mL棉酚标准溶液分别以2、4、6、8、10、12、16、20、24h连续进样9针。结果发现，峰面积分别为801、798、791、785、768、773、749、732、721，可见峰面积稳定，表明该方法稳定性良好。
2.2精密度试验取浓度为10μg/mL棉酚标准溶液连续进样6针，峰面积分别为890、894、888、890、890、885，通过峰面积计算RSD值为0.32%，表明该方法精密度良好。
2.3重复性试验取6份同一样品中棉酚含量进行检测，发现峰面积分别为411、421、420、417、421、423，计算峰面积的RSD值为1.0%，表明该方法重复性良好。
2.4回收率试验对空白样品进行高、中、低3个浓度回收率试验检测，结果发现（表1），棉酚回收率为85.7%～95.8%，回收率较好。
2.5校正曲线的绘制取浓度为21.20μg/mL的标准储备液0.05、0.20、0.40、0.50、1.00、2.00mL分别置于10mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀、备用。以标准液浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线（图1），通过计算得知回归方程为（r=0.999945），表明标准曲线在1.06～42.40μg/mL线性关系良好。
2.6样品测定称取已制备的棉酚样品0.2g（准确至
0.0001g），加入乙醇10mL，超声提取15min，3000r/min离
心5min，将上清液转移至25mL容量瓶中;加入乙醇5mL，超
声10min，离心，重复提取2次。将3次提取的上清液全部转移至25mL容量瓶中，定容，摇匀，避光备用。按“1.4.4”液相色谱条件进行测定，发现棉酚含量为25～4887mg/kg。 3结论与讨论
该研究建立了棉籽粕中游离棉酚的HPLC测定。样品用乙醇提取，用HPLC进行检测。液相条件为AgilentSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）;流动相为甲醇∶0.1%磷酸=85∶15，检测波长235nm，柱温35℃，流速0.8mL/min，进样量10μL。游离棉酚在1.06～42.40μg/mL线性关系良好，精密度、稳定性、重复性的RSD<2%。该方法具有良好的稳定性、准确度、灵敏度和回收率，可以适用于棉籽中游离棉酚的含量测定。
对全疆不同地区25个棉籽样品进行含量测定，由于棉花品种及产地的不同，棉酚含量为25～4887mg/kg。棉酚含量较高，存在潜在的隐患风险，棉籽需要进行脱毒处理后，才能安全使用。
参考文献
[1]沈峥.棉酚与“橡皮蛋”[J].化学教学，2009（12）：50-52.
[2]李梁，刘育晨，杨占君，等.低剂量醋酸棉酚联合十一酸睾丸酮、云氧孕烯和微量炔雌醇可逆抗雄性生育作用[J].解剖学杂志，2017，40（6）：659-664，669.
[3]陈黄鸿，吴勇.棉酚及其衍生物抗肿瘤机制的研究进展[J].医学综述，2017，23（19）：3769-3773.
[4]李玲，刘玉秀，汪清民.棉酚的结构衍生及构效关系研究进展[J].中国科技论文，2015，10（12）：1351-1357.
[5]刘慧，季灵艳，赵天伦，等.陆地棉色素腺體与不同棉酚旋光体含量之间的相关性研究[J].棉花学报，2017，29（5）：437-446.
[6]袁洁，任丽君，李东雨，等.UPLC-MS/MS法测定游离棉酚及其代谢产物棉酚酮在大鼠体内的组织分布[J].新疆医科大学学报，2017，40（11）：1458-1461.
[7]周卫东，郑文新，高维明，等.畜禽产品中游离棉酚风险评估研究进展[J].草食家畜，2014，35（5）：12-15.
[8]中华人民共和国技术监督局.饲料中游离棉酚的测定方法：GB/T13086—1991[S].北京：中国标准出版社，1991.
[9]沈静，阳胜，于红，等.高效薄层色谱法测定棉籽油中游离棉酚含量[J].光谱实验室，2011，28（1）：235-238.
[10]吴伟伟，许赣荣.HPLC法测定棉籽饼粕饲料中的游离棉酚[J].河北农业大学学报，2009，32（5）：105-107，118.
安徽农业科学，J.AnhuiAgric.Sci.2019，47（1）：218-220