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摘要 ：在吉林省7个主要甘薯种植区共采集85份甘薯叶片样品，利用小RNA深度测序技术对混合样品进行检测，经RT-PCR和测序验证，鉴定出样品中存在10种病毒，包括6种RNA病毒和4种DNA病毒。分别是马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属的甘薯羽状斑驳病毒Sweet potato feathery mottle virus （SPFMV）、甘薯潜隐病毒Sweet potato latent virus （SPLV）、甘薯G病毒Sweet potato virus G （SPVG）、甘薯C病毒Sweet potato virus C （SPVC）、甘薯2号病毒Sweet potato virus 2 （SPV2）;长线形病毒科毛形病毒属的甘薯褪绿矮化病毒Sweet potato chlorotic stunt virus （SPCSV）;双生病毒科菜豆金色花叶病毒属的甘薯曲叶病毒Sweet potato leaf curl virus（SPLCV）;玉米线条病毒属的甘薯无症状1号病毒Sweet potato symptomless virus 1 （SPSMV1）;花椰菜花叶病毒科杆状DNA病毒属的甘薯杆状DNA病毒B Sweet potato badnavirus B （SPBV-B）和甘薯隐症病毒Sweet potato pakakuy virus （SPPV）。
关键词 ：甘薯病毒; 小RNA深度测序; 吉林
中图分类号：
S 435.311
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2020090
Identification of viruses in sweet potato samples collected from
Jilin province by small RNA sequencing
ZHANG Chunyu， LI Xiaoyu， LIU Feng， WANG Yongzhi*
（Jilin Academy of Agricultural Sciences， Gongzhuling 136100， China）
Abstract
85 samples of sweet potato leaf were collected from seven main sweet potato areas in Jilin province. Ten species of sweet potato virus were identified， including six RNA viruses and four DNA viruses， by using small RNA deep sequencing， RT-PCR and sequencing. The 10 viruses were Sweet potato feathery mottle virus （SPFMV）， Sweet potato latent virus （SPLV）， Sweet potato virus G （SPVG）， Sweet potato virus C （SPVC） and Sweet potato virus 2 （SPV2） in genus Potyvirus， family Potyviridae; Sweet potato chlorotic stunt virus （SPCSV） in genus Crinivirus， family Closteroviridae; Sweet potato leaf curl virus （SPLCV） in genus Begomovirus， family Geminiviridae; Sweet potato symptomless virus 1 （SPSMV1） in genus Mastrevirus， family Geminiviridae; Sweet potato badnavirus B （SPBV-B） and Sweet potato pakakuy virus （SPPV） in genus Badnavirus， family Caulimoviridae.
Key words
sweet potato viruses; small RNA deep sequencing; Jilin
甘薯Ipomoea batatas （L.） Lam.，旋花科甘薯屬，是我国重要的粮食作物和经济作物。甘薯在吉林省广泛种植，主产区在中部和西部，由于种植区特殊的地理气候特点，甘薯生长期昼夜温差大，品质高，口味佳，深受老百姓喜爱，是重要的经济作物，种植面积逐年增加。甘薯为无性繁殖作物，病毒病危害严重，造成产量质量受损，种质退化等。目前，全世界已鉴定出能够侵染甘薯的病毒共32种，分属于9个科[12]。在我国已发现侵染甘薯的病毒至少达15种[24]，报道最多的是甘薯羽状斑驳病毒Sweet potato feathery mottle virus （SPFMV）、甘薯褪绿矮化病毒Sweet potato chlorotic stunt virus （SPCSV）和双生病毒科的甘薯曲叶病毒Sweet potato leaf curl virus（SPLCV）等。近年来调查发现吉林省甘薯病毒病害日趋严重，但相关报道几乎没有。本研究对吉林省主要甘薯种植区进行采样调查，利用小RNA深度测序和RT-PCR对样品进行鉴定，对病毒种类进行初步了解，为今后甘薯病毒病的防控和脱毒育种提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
调查吉林省甘薯主要种植区松原市长岭县、乾安县，白城市洮南市，长春市，辽源市，白山市抚松县，四平市梨树县等7个地区的大田和苗地病毒病发生情况，采集甘薯病毒病显症叶片及无症（健康）叶片样品共85份，-80℃冰箱保存。 1.2 总RNA提取
采集的甘薯叶片混合样品参照TRIzol说明书提取总RNA，测定浓度。
1.3 小RNA文库建立、测序及分析
混合样品总RNA由北京诺禾致源科技股份有限公司检测，样品检测合格后使用Small RNA Sample Pre Kit构建文库，文库构建完成后先使用Qubit 2.0初步定量，再使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后使用qPCR对文库有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。文库检测合格后進行HiSeq/MiSeq测序，采用无参考基因组寄主病毒sRNA分析流程进行候选病毒评估。
1.4 RT-PCR验证
根据小RNA测序获得的结果，设计病毒引物（表1），以反转录合成的cDNA为模板进行RT-PCR扩增。50 μL PCR反应体系：2×SanTaq PCR Mix 25 μL，引物各2 μL，模板cDNA 0.5 μL，ddH2O 20.5 μL。扩增条件：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环;72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段由吉林省库美生物科技有限公司测序。
2 结果与分析
采集的甘薯混合叶片提取的总RNA浓度为1 459 ng/μL，对其进行质量分析，符合建库要求。样本共获得26 418 427个reads，去除含有接头的、低质量的reads，获得clean reads 26 160 127个，其长度分布见图1。由于病毒感染的植物，富集的viral sRNAs长度主要是3个class，21 nt（15.91%），22 nt（23.69%）和24 nt（24.36%），因此筛选18～26 nt的sRNA进行后续分析。
用bowtie将数据过滤后的sRNA与GenBank Virus RefSeq核酸数据库进行比对，初步鉴定样品感染病毒的list，其中能比对到参考序列的reads数占总reads数的4.06%。通过PFOR和velvet拼接，获得6 082个contigs，长度分布见图2。将拼接所得的contigs进行分类注释，其中与已知的甘薯病毒相关的有11种，见表2。
为验证sRNA注释结果的可靠性，根据拼接序列设计了10种病毒的特异性引物，其中甘薯上海曲叶病毒Sweet potato leaf curl Shanghai virus（SPLCShV）和甘薯加纳利曲叶病毒Sweet potato leaf curl Canary virus（SPLCCV）同为菜豆金色花叶病毒属Begomovirus成员，因此设计了一对该属的通用引物。以反转录获得的cDNA为模板进行RT-PCR检测，均扩增出与预期大小一致的片段（图3）。
其中甘薯褪绿矮化病毒Sweet potato chlorotic stunt virus SPCSV条带较弱，将回收的PCR产物测序，结果通过NCBI进行BLASTn分析，扩增片段均符合目的病毒序列，表明深度测序结果准确。
3 讨论
本研究利用小RNA测序技术，从采集的甘薯叶片混合样本cDNA文库中检测到SPFMV、SPLV、SPVG、SPVC、SPV2、SPCSV、SPLCShV、SPLCCV、SPSMV1、SPBV-B、SPPV等共11种病毒，并应用RT-PCR进行了验证。
其中SPFMV、SPLV、SPVG、SPVC、SPV2为马铃薯Y病毒科Potyviridae马铃薯Y病毒属Potyvirus成员。SPFMV是近年来报道侵染甘薯的病毒中分布最广泛，危害最大的病毒，被其单独侵染的植株多数不表现症状或叶片呈轻度斑驳。SPFMV通常与线性病毒科Closteroviridae毛形病毒属Crinivirus的SPCSV共同侵染，产生的病害简称甘薯病毒病害sweet potato virus diseases（SPVD）[5]。SPVD造成植株丛生矮化，叶片变小，扭曲畸形，叶绿素含量降低，严重时造成70% 以上的减产，甚至绝收，其发生症状与病毒积累量有一定关系，潜伏期可长达3年[6]。
SPLCV为双生病毒科Geminiviridae菜豆金色花叶病毒属Begomovirus成员。田间被SPLCV侵染的植株并不常表现典型的曲叶症状，或者表现症状维持的时间很短[7]，但会对某些品种的甘薯造成严重的产量损失。例如Clark等[8]，Ling等[9]发现SPLCV侵染甘薯品种‘Beauregard’虽不表现典型的曲叶症状，却导致甘薯产量损失26%及63%。目前，侵染甘薯的Begomovirus病毒共分为13个正式种，本研究中小RNA深度测序比对到的Begomovirus病毒有2种，分别为SPLCShV和SPLCCV，其中SPLCShV为暂定种。设计了一对该属病毒的通用引物，对RT-PCR获得的片段测序分析，鉴定为甘薯曲叶病毒Sweet potato leaf curl virus。在后续试验中，会进一步对单个样品感染的Begomovirus病毒进行序列分析鉴定。
SPBV-B和SPPV为花椰菜花叶病毒科Caulimoviridae杆状病毒属Badnavirus成员，其中SPBV-B为暂定种。
本文首次对吉林省的甘薯病毒病进行了初步普查，利用小RNA深度测序方法鉴定出分属4个科的10种病毒，为甘薯脱毒繁育提供了重要的理论依据。
参考文献
[1] CLARK A， DAVIS J A， ABAD J A， et al. Sweet potato viruses： 15 years of progress on understanding and managing complex diseases [J]. Plant Disease， 2012， 96（2）： 168185. [2] 乔奇， 张振臣， 张德胜， 等. 中国甘薯病毒种类的血清学和分子检测[J].植物病理学报， 2012， 42（1）： 1016.
[3] WANG Qingmei， ZHANG Liming， WANG Biao， et al. Sweetpotato viruses in China [J]. Crop Protection， 2010， 29（2）： 110114.
[4] XIE Y P， XING J Y， LI X Y， et al. Survey of sweetpotato viruses in China [J]. Acta Virologica， 2013， 57（1）： 8184.
[5] 张振臣， 乔奇， 秦艳红， 等， 我国发现由甘薯褪绿矮化病毒和甘薯羽状斑驳病毒协生共侵染引起的甘薯病毒病害[J]. 植物病理学报， 2012， 42（3）： 328333.
[6] 刘新亮， 阜阳市甘薯复合病毒病（SPVD）现状与预防措施[J].农业灾害研究， 2019， 9（4）： 1819.
[7] VALVERDE R A， CLARK C A， VALKONEN J P T. Viruses and virus disease complexes of sweetpotato [J]. Plant Viruses， 2007， 1（1）： 116126.
[8] CLARK C A， HOY M W. Effects of common viruses on yield and quality of Beauregard sweetpotato in Louisiana [J]. Plant Disease， 2006， 90（1）： 8388.
[9] LING Kaishu， JACKSON D M， HARRISON H， et al. Field evaluation of yield effects on the U.S.A. heirloom sweetpotato cultivars infected by Sweet potato leaf curl virus [J]. Crop Protection， 2010， 29（7）： 757765.
（責任编辑：田 喆）
关键词 ：甘薯病毒; 小RNA深度测序; 吉林
中图分类号：
S 435.311
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2020090
Identification of viruses in sweet potato samples collected from
Jilin province by small RNA sequencing
ZHANG Chunyu， LI Xiaoyu， LIU Feng， WANG Yongzhi*
（Jilin Academy of Agricultural Sciences， Gongzhuling 136100， China）
Abstract
85 samples of sweet potato leaf were collected from seven main sweet potato areas in Jilin province. Ten species of sweet potato virus were identified， including six RNA viruses and four DNA viruses， by using small RNA deep sequencing， RT-PCR and sequencing. The 10 viruses were Sweet potato feathery mottle virus （SPFMV）， Sweet potato latent virus （SPLV）， Sweet potato virus G （SPVG）， Sweet potato virus C （SPVC） and Sweet potato virus 2 （SPV2） in genus Potyvirus， family Potyviridae; Sweet potato chlorotic stunt virus （SPCSV） in genus Crinivirus， family Closteroviridae; Sweet potato leaf curl virus （SPLCV） in genus Begomovirus， family Geminiviridae; Sweet potato symptomless virus 1 （SPSMV1） in genus Mastrevirus， family Geminiviridae; Sweet potato badnavirus B （SPBV-B） and Sweet potato pakakuy virus （SPPV） in genus Badnavirus， family Caulimoviridae.
Key words
sweet potato viruses; small RNA deep sequencing; Jilin
甘薯Ipomoea batatas （L.） Lam.，旋花科甘薯屬，是我国重要的粮食作物和经济作物。甘薯在吉林省广泛种植，主产区在中部和西部，由于种植区特殊的地理气候特点，甘薯生长期昼夜温差大，品质高，口味佳，深受老百姓喜爱，是重要的经济作物，种植面积逐年增加。甘薯为无性繁殖作物，病毒病危害严重，造成产量质量受损，种质退化等。目前，全世界已鉴定出能够侵染甘薯的病毒共32种，分属于9个科[12]。在我国已发现侵染甘薯的病毒至少达15种[24]，报道最多的是甘薯羽状斑驳病毒Sweet potato feathery mottle virus （SPFMV）、甘薯褪绿矮化病毒Sweet potato chlorotic stunt virus （SPCSV）和双生病毒科的甘薯曲叶病毒Sweet potato leaf curl virus（SPLCV）等。近年来调查发现吉林省甘薯病毒病害日趋严重，但相关报道几乎没有。本研究对吉林省主要甘薯种植区进行采样调查，利用小RNA深度测序和RT-PCR对样品进行鉴定，对病毒种类进行初步了解，为今后甘薯病毒病的防控和脱毒育种提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
调查吉林省甘薯主要种植区松原市长岭县、乾安县，白城市洮南市，长春市，辽源市，白山市抚松县，四平市梨树县等7个地区的大田和苗地病毒病发生情况，采集甘薯病毒病显症叶片及无症（健康）叶片样品共85份，-80℃冰箱保存。 1.2 总RNA提取
采集的甘薯叶片混合样品参照TRIzol说明书提取总RNA，测定浓度。
1.3 小RNA文库建立、测序及分析
混合样品总RNA由北京诺禾致源科技股份有限公司检测，样品检测合格后使用Small RNA Sample Pre Kit构建文库，文库构建完成后先使用Qubit 2.0初步定量，再使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后使用qPCR对文库有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。文库检测合格后進行HiSeq/MiSeq测序，采用无参考基因组寄主病毒sRNA分析流程进行候选病毒评估。
1.4 RT-PCR验证
根据小RNA测序获得的结果，设计病毒引物（表1），以反转录合成的cDNA为模板进行RT-PCR扩增。50 μL PCR反应体系：2×SanTaq PCR Mix 25 μL，引物各2 μL，模板cDNA 0.5 μL，ddH2O 20.5 μL。扩增条件：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环;72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段由吉林省库美生物科技有限公司测序。
2 结果与分析
采集的甘薯混合叶片提取的总RNA浓度为1 459 ng/μL，对其进行质量分析，符合建库要求。样本共获得26 418 427个reads，去除含有接头的、低质量的reads，获得clean reads 26 160 127个，其长度分布见图1。由于病毒感染的植物，富集的viral sRNAs长度主要是3个class，21 nt（15.91%），22 nt（23.69%）和24 nt（24.36%），因此筛选18～26 nt的sRNA进行后续分析。
用bowtie将数据过滤后的sRNA与GenBank Virus RefSeq核酸数据库进行比对，初步鉴定样品感染病毒的list，其中能比对到参考序列的reads数占总reads数的4.06%。通过PFOR和velvet拼接，获得6 082个contigs，长度分布见图2。将拼接所得的contigs进行分类注释，其中与已知的甘薯病毒相关的有11种，见表2。
为验证sRNA注释结果的可靠性，根据拼接序列设计了10种病毒的特异性引物，其中甘薯上海曲叶病毒Sweet potato leaf curl Shanghai virus（SPLCShV）和甘薯加纳利曲叶病毒Sweet potato leaf curl Canary virus（SPLCCV）同为菜豆金色花叶病毒属Begomovirus成员，因此设计了一对该属的通用引物。以反转录获得的cDNA为模板进行RT-PCR检测，均扩增出与预期大小一致的片段（图3）。
其中甘薯褪绿矮化病毒Sweet potato chlorotic stunt virus SPCSV条带较弱，将回收的PCR产物测序，结果通过NCBI进行BLASTn分析，扩增片段均符合目的病毒序列，表明深度测序结果准确。
3 讨论
本研究利用小RNA测序技术，从采集的甘薯叶片混合样本cDNA文库中检测到SPFMV、SPLV、SPVG、SPVC、SPV2、SPCSV、SPLCShV、SPLCCV、SPSMV1、SPBV-B、SPPV等共11种病毒，并应用RT-PCR进行了验证。
其中SPFMV、SPLV、SPVG、SPVC、SPV2为马铃薯Y病毒科Potyviridae马铃薯Y病毒属Potyvirus成员。SPFMV是近年来报道侵染甘薯的病毒中分布最广泛，危害最大的病毒，被其单独侵染的植株多数不表现症状或叶片呈轻度斑驳。SPFMV通常与线性病毒科Closteroviridae毛形病毒属Crinivirus的SPCSV共同侵染，产生的病害简称甘薯病毒病害sweet potato virus diseases（SPVD）[5]。SPVD造成植株丛生矮化，叶片变小，扭曲畸形，叶绿素含量降低，严重时造成70% 以上的减产，甚至绝收，其发生症状与病毒积累量有一定关系，潜伏期可长达3年[6]。
SPLCV为双生病毒科Geminiviridae菜豆金色花叶病毒属Begomovirus成员。田间被SPLCV侵染的植株并不常表现典型的曲叶症状，或者表现症状维持的时间很短[7]，但会对某些品种的甘薯造成严重的产量损失。例如Clark等[8]，Ling等[9]发现SPLCV侵染甘薯品种‘Beauregard’虽不表现典型的曲叶症状，却导致甘薯产量损失26%及63%。目前，侵染甘薯的Begomovirus病毒共分为13个正式种，本研究中小RNA深度测序比对到的Begomovirus病毒有2种，分别为SPLCShV和SPLCCV，其中SPLCShV为暂定种。设计了一对该属病毒的通用引物，对RT-PCR获得的片段测序分析，鉴定为甘薯曲叶病毒Sweet potato leaf curl virus。在后续试验中，会进一步对单个样品感染的Begomovirus病毒进行序列分析鉴定。
SPBV-B和SPPV为花椰菜花叶病毒科Caulimoviridae杆状病毒属Badnavirus成员，其中SPBV-B为暂定种。
本文首次对吉林省的甘薯病毒病进行了初步普查，利用小RNA深度测序方法鉴定出分属4个科的10种病毒，为甘薯脱毒繁育提供了重要的理论依据。
参考文献
[1] CLARK A， DAVIS J A， ABAD J A， et al. Sweet potato viruses： 15 years of progress on understanding and managing complex diseases [J]. Plant Disease， 2012， 96（2）： 168185. [2] 乔奇， 张振臣， 张德胜， 等. 中国甘薯病毒种类的血清学和分子检测[J].植物病理学报， 2012， 42（1）： 1016.
[3] WANG Qingmei， ZHANG Liming， WANG Biao， et al. Sweetpotato viruses in China [J]. Crop Protection， 2010， 29（2）： 110114.
[4] XIE Y P， XING J Y， LI X Y， et al. Survey of sweetpotato viruses in China [J]. Acta Virologica， 2013， 57（1）： 8184.
[5] 张振臣， 乔奇， 秦艳红， 等， 我国发现由甘薯褪绿矮化病毒和甘薯羽状斑驳病毒协生共侵染引起的甘薯病毒病害[J]. 植物病理学报， 2012， 42（3）： 328333.
[6] 刘新亮， 阜阳市甘薯复合病毒病（SPVD）现状与预防措施[J].农业灾害研究， 2019， 9（4）： 1819.
[7] VALVERDE R A， CLARK C A， VALKONEN J P T. Viruses and virus disease complexes of sweetpotato [J]. Plant Viruses， 2007， 1（1）： 116126.
[8] CLARK C A， HOY M W. Effects of common viruses on yield and quality of Beauregard sweetpotato in Louisiana [J]. Plant Disease， 2006， 90（1）： 8388.
[9] LING Kaishu， JACKSON D M， HARRISON H， et al. Field evaluation of yield effects on the U.S.A. heirloom sweetpotato cultivars infected by Sweet potato leaf curl virus [J]. Crop Protection， 2010， 29（7）： 757765.
（責任编辑：田 喆）