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【摘要】目的：观察高浓度脂多糖对正常人皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原及胶原酶mRNA表达的影响，探讨脂多糖与创面愈合的关系。方法：体外培养正常人皮肤成纤维细胞，应用不同浓度（0.5～3.0μg/ml）的大肠杆菌LPS（E.coli055：B5）对成纤维细胞进行刺激，并对刺激后细胞传代至表型稳定（第3代），采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测LPS对成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原及胶原酶mRNA的表达的调控作用，观察剂量-效应关系。结果：脂多糖刺激浓度为0.5μg/ml时，促进成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达，抑制胶原酶mRNA;脂多糖刺激浓度在1-3μg/ml之间，抑制正常皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达，促进胶原酶mRNA表达，且作用浓度与抑制效果呈量效依赖关系。结论：高浓度脂多糖抑制成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达、促进胶原酶mRNA表达。提示LPS可能是创面迁延不愈的原始诱导因素之一。
【关键词】脂多糖类;信使核糖核酸;成纤维细胞
【中图分类号】R346 【文献标识码】B 【文章编号】2095―8439（2015）05―0059―02
深度烧伤创面通常会有部分不愈合，并逐渐形成慢性创面，经久不愈，给患者身心造成很大的痛苦，同时也困扰医务工作者，成为深度烧伤创面所必须面对的难题[1]。既往研究实验结果也证实了这一点[2]。本研究拟通过高浓度脂多糖刺激后的正常人皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原及胶原酶mRNA表达情况，探讨细菌感染对烧伤创面愈合的影响。
1 材料与方法
1标本选择标准及来源 标本来源于我所收治的增生性瘢痕需整复手术的患者20例，其中男性11例，女性9例;年龄2-56岁，平均（20±15）岁。整复手术中获取的正常皮肤用于成纤维细胞的培养和观察。获取标本前均征得患者本人或家属同意。
1.1 主要试剂和仪器：Dulbecco改良的培养基（DulbeccomodifiedEaglemedium，DMEM）及胰蛋白酶（美国Gibco公司）;LPSE.coli055：B5（美国Sigma公司）;胎牛血清（fetalcalfserum，FCS）（中科院生物制品研究所）;乙二胺四乙酸（EDTA）（华美生物工程公司）;TRIzol总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、二乙基焦碳酸乙酯（DEPC）、DNAMarker及琼脂糖均购自（美国Promega公司）。DNA扩增仪（美国PE公司）、超低温离心机及CO2孵箱（日本SANYO公司）及超净工作台（哈尔滨东联电技术开发有限公司）。
1.2 引物合成：以PrimerExpressTM1.0软件设计引物，由赛百胜公司合成，聚丙烯酰胺凝胶纯化。Ⅰ型前胶原上游引物：5’CTGGTCCCAAGGGTAACAG3’，下游引物：5’ACTTGCCAAGAGGACCG3’，扩增片段长度285bp;Ⅲ型前胶原上游引物：5’CTGCCATCCAGAACTCAAGAGTGG3’，下游引物：5’GGATGTGTCAAGTCCTCCTACC3’，扩增片段长度447bp;胶原酶上游引物：5’TCCTGTGGCATCCACGAAACT3’，下游引物：5’-TAGCAGGTGGCGTTACGAAG3’，扩增片段长度245bp;内参照β-肌动蛋白上游引物：5’-CCCATCACCATCTTCCAG-3’，下游引物：5’GGTGAGAACTCAAGACCTACCGTC3’，扩增片段长度313bp。
1.3 成纤维细胞培养：取正常皮肤及增生性瘢痕组织采用黄勇等[3]方法进行原代培养。基础培养基为DMEM，添加FCS（10%）、青霉素（100U/ml）、链霉素（100U/ml）。在37℃、5%CO2及95%空气、饱和湿度的CO2孵箱中培养，每周更换培养基2～3次。原代培养接近80%融合时，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化传代，形成细胞系。取第3代正常皮肤成纤维细胞用于LPS干预实验。
1.4 LPS作用浓度及时间：用4%基础培养基稀释LPS，最终实验浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、3.0μg/ml，对正常皮肤成纤维细胞进行刺激，并对刺激后细胞进行传代，待表型稳定后用于总RNA的提取。
1.5 培养细胞的总RNA制备：按文献[4]法提取细胞总RNA，抽提的总RNA溶于适量0.1%DEPC处理水中，经紫外分光光度计测定其吸光度（A）值，且A260/280之比在1.73-2.32之间，符合试验要求，-70℃冰箱保存备用。
1.6 逆转录：取已提取的总RNA1μg，加入无菌双蒸水至体积10ul，按照GibcoBRL公司逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应。
1.7 PCR扩增：原胶原（Ⅰ）、（Ⅲ）、胶原酶及β-actin（内参照）：取逆转录产物cDNA1ul，引物以无菌双蒸水溶解浓度为10umol/ml，各取2.5ul，按PCR法扩增，体积浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳、照相，并对电泳条带进行计算机灰度扫描。
1.8 RT-PCR产物半定量分析：结果以相对值随机单位（arbitraryunits，RI）表示，RI（%）=（观察产物A值/β-actinA值）×100。
1.9 统计学处理：采用采用SPSS13.0统计程序包进行单因素方差分析（F检验和q检验），P<0.05具有统计学意义。
2 结果
2.1 脂多糖刺激浓度为0.5μg/ml时，促进成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达，抑制胶原酶mRNA;脂多糖刺激浓度在1-3μg/ml之间，抑制正常皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达，促进胶原酶mRNA表达，且作用浓度与抑制效果呈量效依赖关系。（表1）。
3 讨论
烧伤创面是一种伴有组织坏死，并可能形成缺损性损伤的创伤，其愈合过程有独特的规律。及时清除坏死组织、及早封闭创面是治疗深度烧伤的基本原则。深Ⅱ度烧伤创面可通过残留的上皮组织上皮化而自行愈合。但是大面积深Ⅱ度以上烧伤在脱痂过程中易发生严重感染，影响创面的愈合，甚至危及生命。成纤维细胞是参与创面愈合的主要细胞，其生物学行为的变化，尤其是其增殖活性或胶原合成能力的改变，直接影响创面愈合的进程和结局。深度烧伤创面愈合过程中常遗留残余创面，临床处理难度较大。形成残余创面的主要原因包括创面局部水肿、血运差、肉芽老化、细菌耐药以及植皮手术方式选择不当等。
李新月[3]研究发现，高浓度LPS抑制人牙周膜细胞中骨涎蛋白的基因表达，抑制成骨细胞活性。李小娜等研究发现，LPS介导下牙周膜成纤维细胞MMP-1和MMP-2分泌量和基因表达升高，进而可促进人牙周膜细胞的胶原降解。体外实验研究证实，脂多糖可以刺激正常人皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成[2]，ZhengyuHe等研究发现脂多糖通过Toll样受体4信号通路和PI3KAkt通路诱导肺成纤维细胞增殖。YYamaji等研究发现细菌脂多糖可刺激人牙周膜成纤维细胞炎性细胞因子的基因表达。HEJasin等研究发现细菌脂多糖通过软骨细胞的活化诱导软骨基质的体外降解。那么，脂多糖是否能够抑制成纤维细胞的胶原合成而促进其讲解呢？而成纤维细胞增殖能力下降和胶原合成能力减低是创面难以愈合的表现之一。那么高浓度内毒素刺激是否可改变正常皮肤成纤维细胞的胶原合成和降解之间的平衡，既往研究尚未涉及。本实验结果显示，高脂多糖在抑制成纤维细胞的胶原合成的同时，还促进胶原蛋降解，并且随着脂多糖刺激浓度增加而作用增强，提示高浓度脂多糖可能是创面不愈的始发因素之一。也就是说创面感染越重越难以愈合，并可能形成慢性创面。
[1]李冬军，赵洪良，李明.硝普钠和磺胺嘧啶银联合应用对大鼠深II度烧伤创面愈合的影响[J].中国美容医学，2013，22（1）：59-61.
[2]YangHM，KankoM，HeC，etal.EffectofalipopolysaccharidefromE.coliontheproliferationoffibroblastsandkeratinocytesinvitro.PhytotherRes，2002，16：43-47.
[3]李新月.脂多糖调节牙周膜成纤维细胞骨涎蛋白基因表达.中国城乡企业卫生，2014，2：51-54.
【关键词】脂多糖类;信使核糖核酸;成纤维细胞
【中图分类号】R346 【文献标识码】B 【文章编号】2095―8439（2015）05―0059―02
深度烧伤创面通常会有部分不愈合，并逐渐形成慢性创面，经久不愈，给患者身心造成很大的痛苦，同时也困扰医务工作者，成为深度烧伤创面所必须面对的难题[1]。既往研究实验结果也证实了这一点[2]。本研究拟通过高浓度脂多糖刺激后的正常人皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原及胶原酶mRNA表达情况，探讨细菌感染对烧伤创面愈合的影响。
1 材料与方法
1标本选择标准及来源 标本来源于我所收治的增生性瘢痕需整复手术的患者20例，其中男性11例，女性9例;年龄2-56岁，平均（20±15）岁。整复手术中获取的正常皮肤用于成纤维细胞的培养和观察。获取标本前均征得患者本人或家属同意。
1.1 主要试剂和仪器：Dulbecco改良的培养基（DulbeccomodifiedEaglemedium，DMEM）及胰蛋白酶（美国Gibco公司）;LPSE.coli055：B5（美国Sigma公司）;胎牛血清（fetalcalfserum，FCS）（中科院生物制品研究所）;乙二胺四乙酸（EDTA）（华美生物工程公司）;TRIzol总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、二乙基焦碳酸乙酯（DEPC）、DNAMarker及琼脂糖均购自（美国Promega公司）。DNA扩增仪（美国PE公司）、超低温离心机及CO2孵箱（日本SANYO公司）及超净工作台（哈尔滨东联电技术开发有限公司）。
1.2 引物合成：以PrimerExpressTM1.0软件设计引物，由赛百胜公司合成，聚丙烯酰胺凝胶纯化。Ⅰ型前胶原上游引物：5’CTGGTCCCAAGGGTAACAG3’，下游引物：5’ACTTGCCAAGAGGACCG3’，扩增片段长度285bp;Ⅲ型前胶原上游引物：5’CTGCCATCCAGAACTCAAGAGTGG3’，下游引物：5’GGATGTGTCAAGTCCTCCTACC3’，扩增片段长度447bp;胶原酶上游引物：5’TCCTGTGGCATCCACGAAACT3’，下游引物：5’-TAGCAGGTGGCGTTACGAAG3’，扩增片段长度245bp;内参照β-肌动蛋白上游引物：5’-CCCATCACCATCTTCCAG-3’，下游引物：5’GGTGAGAACTCAAGACCTACCGTC3’，扩增片段长度313bp。
1.3 成纤维细胞培养：取正常皮肤及增生性瘢痕组织采用黄勇等[3]方法进行原代培养。基础培养基为DMEM，添加FCS（10%）、青霉素（100U/ml）、链霉素（100U/ml）。在37℃、5%CO2及95%空气、饱和湿度的CO2孵箱中培养，每周更换培养基2～3次。原代培养接近80%融合时，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化传代，形成细胞系。取第3代正常皮肤成纤维细胞用于LPS干预实验。
1.4 LPS作用浓度及时间：用4%基础培养基稀释LPS，最终实验浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、3.0μg/ml，对正常皮肤成纤维细胞进行刺激，并对刺激后细胞进行传代，待表型稳定后用于总RNA的提取。
1.5 培养细胞的总RNA制备：按文献[4]法提取细胞总RNA，抽提的总RNA溶于适量0.1%DEPC处理水中，经紫外分光光度计测定其吸光度（A）值，且A260/280之比在1.73-2.32之间，符合试验要求，-70℃冰箱保存备用。
1.6 逆转录：取已提取的总RNA1μg，加入无菌双蒸水至体积10ul，按照GibcoBRL公司逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应。
1.7 PCR扩增：原胶原（Ⅰ）、（Ⅲ）、胶原酶及β-actin（内参照）：取逆转录产物cDNA1ul，引物以无菌双蒸水溶解浓度为10umol/ml，各取2.5ul，按PCR法扩增，体积浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳、照相，并对电泳条带进行计算机灰度扫描。
1.8 RT-PCR产物半定量分析：结果以相对值随机单位（arbitraryunits，RI）表示，RI（%）=（观察产物A值/β-actinA值）×100。
1.9 统计学处理：采用采用SPSS13.0统计程序包进行单因素方差分析（F检验和q检验），P<0.05具有统计学意义。
2 结果
2.1 脂多糖刺激浓度为0.5μg/ml时，促进成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达，抑制胶原酶mRNA;脂多糖刺激浓度在1-3μg/ml之间，抑制正常皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达，促进胶原酶mRNA表达，且作用浓度与抑制效果呈量效依赖关系。（表1）。
3 讨论
烧伤创面是一种伴有组织坏死，并可能形成缺损性损伤的创伤，其愈合过程有独特的规律。及时清除坏死组织、及早封闭创面是治疗深度烧伤的基本原则。深Ⅱ度烧伤创面可通过残留的上皮组织上皮化而自行愈合。但是大面积深Ⅱ度以上烧伤在脱痂过程中易发生严重感染，影响创面的愈合，甚至危及生命。成纤维细胞是参与创面愈合的主要细胞，其生物学行为的变化，尤其是其增殖活性或胶原合成能力的改变，直接影响创面愈合的进程和结局。深度烧伤创面愈合过程中常遗留残余创面，临床处理难度较大。形成残余创面的主要原因包括创面局部水肿、血运差、肉芽老化、细菌耐药以及植皮手术方式选择不当等。
李新月[3]研究发现，高浓度LPS抑制人牙周膜细胞中骨涎蛋白的基因表达，抑制成骨细胞活性。李小娜等研究发现，LPS介导下牙周膜成纤维细胞MMP-1和MMP-2分泌量和基因表达升高，进而可促进人牙周膜细胞的胶原降解。体外实验研究证实，脂多糖可以刺激正常人皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成[2]，ZhengyuHe等研究发现脂多糖通过Toll样受体4信号通路和PI3KAkt通路诱导肺成纤维细胞增殖。YYamaji等研究发现细菌脂多糖可刺激人牙周膜成纤维细胞炎性细胞因子的基因表达。HEJasin等研究发现细菌脂多糖通过软骨细胞的活化诱导软骨基质的体外降解。那么，脂多糖是否能够抑制成纤维细胞的胶原合成而促进其讲解呢？而成纤维细胞增殖能力下降和胶原合成能力减低是创面难以愈合的表现之一。那么高浓度内毒素刺激是否可改变正常皮肤成纤维细胞的胶原合成和降解之间的平衡，既往研究尚未涉及。本实验结果显示，高脂多糖在抑制成纤维细胞的胶原合成的同时，还促进胶原蛋降解，并且随着脂多糖刺激浓度增加而作用增强，提示高浓度脂多糖可能是创面不愈的始发因素之一。也就是说创面感染越重越难以愈合，并可能形成慢性创面。
[1]李冬军，赵洪良，李明.硝普钠和磺胺嘧啶银联合应用对大鼠深II度烧伤创面愈合的影响[J].中国美容医学，2013，22（1）：59-61.
[2]YangHM，KankoM，HeC，etal.EffectofalipopolysaccharidefromE.coliontheproliferationoffibroblastsandkeratinocytesinvitro.PhytotherRes，2002，16：43-47.
[3]李新月.脂多糖调节牙周膜成纤维细胞骨涎蛋白基因表达.中国城乡企业卫生，2014，2：51-54.