论文部分内容阅读
摘要：为研究信号转导与转录激活因子3（STAT3）的活性调控机制，克隆人源STAT3基因，并将其构建在真核表达载体上。之后，通过细胞内共表达STAT3和泛素化质粒的方法，验证了STAT3蛋白可以发生多种类型的泛素化修饰。结果表明，K63位非降解功能的泛素化影响STAT3蛋白的磷酸化，从而影响STAT3的活性及功能的发挥；而K48位降解功能的泛素化影响STAT3蛋白的降解，使STAT3蛋白得以更新，这2种类型的泛素化对STAT3蛋白及其功能都十分重要。
关键词：STAT3蛋白；表达载体；泛素化；K63；K48
中图分类号： Q78文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）11-0016-03
化[5]。信号转导与转录激活因子家族（STAT）已发现7个成员，STAT3是该家族的研究热点，且敲除该基因可以使胚胎死亡，说明该基因是不可或缺的。磷酸化修饰是调控STAT3活性的主要方式，Tyr705、Ser727是磷酸化的关键氨基酸位点[6]。此外，STAT3的Lys685可以在组蛋白乙酰转移酶的修饰下发生可逆乙酰化[7-8]。
在真核细胞中，蛋白质的泛素化和磷酸化是最常见的翻译后修饰。细胞外信号严格调控着蛋白的泛素化，在很多情况下，这种调控依赖于蛋白质的磷酸化[9]。磷酸化通过修饰泛素化的底物，或者修饰泛素化机器的某个组分来影响泛素化。此外，泛素化对于磷酸化和信号分子的传递也有一定的作用。本研究通过研究STAT3蛋白是否会发生泛素化，发生哪种类型的泛素化，并以此解释泛素化与STAT3活性之间的关系。
1材料与方法
1.1试验材料
Taq DNA polymerase，购自北京鼎国生物技术有限公司；T4 DNA连接酶、pMD-19-T simple Vector、DNA酶Ⅰ、Oligo（dT）18、Random promers、PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）Kit，购自TaKaRa公司；dNTPs，购自北京盛旭百川生物科技有限公司；DNA分子量标准品，购自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；蛋白质非预染分子量标准marker及预染分子量标准marker，购自Fermentas公司；Tween-20，购自Amresco公司；质粒小量提取试剂盒、EASYspin plus RNA提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；质粒大量提取试剂盒、Enhanced chemiluminescence（ECL）kit，购自北京康为世纪生物科技有限公司；DNA凝胶回收纯化试剂盒，购自Zymo公司；无内毒素大量质粒提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；Anti-c-HA单克隆抗体、protein A/G plus-agarose（SC-2003），购自Santa Cruz生物公司；Anti-FLAG M2（F1804）单克隆抗体、PI染料，购自Sigma公司；HRP-标记山羊抗小鼠和山羊抗兔抗體，购自北京鼎国生物技术有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂，购自Invitrogen公司；蛋白酶抑制剂，购自亚太恒信生物科技（北京）有限公司；Sal Ⅰ和Hind Ⅲ酶，购自NEB公司；HA-ub、HA-KO、HA-K48、HA-K63等载体质粒均由唐军教授馈赠；所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.2Human STAT3基因的克隆
根据NCBI STAT3（ID：47080104）基因序列设计引物，上游引物为5′-ATGGCCCAATGGAATCAGC-3′，下游引物为5′-TCACATGGGGGAGGTAGCGC-3′。建立50 μL PCR反应体系：5 μL 10×PCR Buffer，2 μL 10 mmol/L dNTPs，20 pmol/L 上下游引物各1 μL，4 μL cDNA，1 μL Taq plus DNA polymerase，用ddH2O补至50 μL。按以下程序进行PCR反应：94 ℃预变性5 min，进入循环：94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸2.5 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物，目的基因大小为 2 313 bp。
1.3宿主细胞蛋白STAT3重组质粒的构建
针对pRK5-flag质粒多克隆位点设计引物并引入SalⅠ和HindⅢ酶切位点，以测序正确的pMD-19-T-STAT3质粒为模板进行PCR；1.5%琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物后，进行SalⅠ和HindⅢ双酶切，同时对pRK5-flag质粒进行 SalⅠ 和HindⅢ双酶切，1.0%琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物；将PCR酶切产物和pRK5-flag酶切产物按6 ∶1摩尔比混合，并加入等量的（5 μL）Solution I（酶溶液），过夜连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α；挑取单克隆，提取质粒酶切鉴定正确后，由北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，测序正确克隆保存菌种，并提取质粒待用。
pRK5-flag-STAT3：上下游引物分别引入SalⅠ和HindⅢ酶切位点，上游引物为5′-ACGCGTCGACATGGCCCAATGGAATCAGCTAC-3′，下游引物为5′-CCCAAGCTTTCACATGGGGGAGGTAGCGCAC-3′。
1.4STAT3泛素化的检测
6孔板分别按下述方式转染HEK293T细胞，其中pRK5-flag空载体组作为阴性对照：（1）pRK5-flag HA-ub；（2）pRK5-flag-STAT3 HA-ub；（3）pRK5-flag HA-KO；（4）pRK5-flag-STAT3 HA-K48；（5）pRK5-flag-STAT3 HA-K63。 细胞内泛素化：（1）质粒转染后20 h（即收获细胞蛋白前4 h），加入20 μmol/L MG132抑制蛋白酶体的降解作用。（2）收获细胞蛋白。用冰预冷的1×PBS轻轻漂洗细胞2次。（3）配制裂解工作液。1 mL Lysis buffer中加入10 μmol/L二硫苏糖醇溶液，1×cocktail C蛋白酶抑制，10 mmol/L N-乙基顺丁烯二酰亚胺和终浓度为1%的十二烷基硫酸钠溶液（SDS）。（4）6孔板每个孔中加入80 μL现用现配的裂解工作液，将细胞刮下转移至1.5 mL的离心管中。（5）将离心管放入 95 ℃ 金属浴中，灭活10 min。（6）超声波（功率10%）破碎细胞沉淀1 min。（7）每管加入720 μL不含（SDS）的裂解工作液，4 ℃、12 000 r/min离心20 min。（8）取出50 μL离心上清液作为Input，其余上清液加入到含有偶联Flag抗体的beads离心管中，4 ℃旋转孵育过夜。（9）过夜孵育之后，用 1×Lysis buffer洗涤beads 3次（4 ℃、3 000 r/min、3 min）。（10）加入20 μL 2×SDS蛋白上样缓冲液，于100 ℃煮 10 min，立即进行Western Blot检测。
2结果与分析
2.1人源STAT3基因的克隆
为获取人源基因STAT3，使用Trizol法提取HEK293T细胞的总RNA，以其为模板利用RT-PCR扩增STAT3基因。扩增得到片段大小约为2 310 bp，如图1所示。随后将2种PCR产物分别与pMD-19-T载体连接，并将转化后长出的阳性克隆进行测序。测序结果表明，构建并保存在pMD-19-T载体中的STAT3基因与NCBI上登陆的参考序列在氨基酸水平上完全相同，可用于后续试验中。
2.2STAT3基因重组载体的构建
根据试验需要，将STAT3基因分别插入相应的表达载体内，经双酶切鉴定及测序比对正确后作质粒大量提取，用于后续的试验。依据试验需求构建重组载体pRK5-flag-STAT3，重组载体的酶切鉴定结果如图2所示。
2.3pRK5-flag-STAT3質粒的验证表达
将pRK5-flag-STAT3质粒转染入HEK293T细胞，转染24 h后收获细胞蛋白，进行Western Blot验证。如图3所示，pRK5-flag-STAT3在细胞中表达良好，可以用于后续试验。
2.4STAT3蛋白可以发生泛素化
为验证STAT3蛋白能否发生泛素化修饰，将构建的pRK5-flag-STAT3真核表达载体以及pRK5-flag与 HA-ub 一起转染HEK293T细胞，为保证能有效捕捉蛋白泛素化修饰，在转染20 h后收集细胞裂解液，并进行免疫共沉淀，孵育2 h后，进行Western Blot检测，如图4所示，STAT3可以发生泛素化修饰。
2.5STAT3蛋白泛素化类型确定
泛素分子全长包含7个赖氨酸位点（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）和1个位于C端的甘氨酸位点以及位于N端的甲硫氨酸位点。泛素自身的每个赖氨酸位点以及N端的
甲硫氨酸位点都可以发生泛素化从而延伸泛素链[10-11]，其中对K48、K63位多聚泛素化的研究最广泛。按照试验方法中所述，将构建的pRK5-flag-STAT3真核表达载体以及pRK5-flag分别与HA-ub、HA-KO、HA-K48、HA-K48一起转染HEK293T细胞，在转染20 h后收集细胞裂解液，并进行免疫共沉淀，孵育2 h后，进行Western Blot检测，如图5所示，STAT3可以发生多种类型的泛素化修饰。
3结果与讨论
STAT3蛋白作为信号通路中一个关键的分子，在受到外界信号刺激时，会发生磷酸化和二聚体化，转化为活性形式的pSTAT3，进入细胞核发挥转录激活的作用。
本研究通过克隆的方法获得了人源STAT3基因，并将其构建在pRK5-flag表达载体上。之后将pRK5-flag-STAT3和泛素质粒共转染细胞，确认STAT3可以发生泛素化修饰，并可以发生Ko、K48、K63等多种类型的泛素化。已有研究报道K63位的泛素化中在信号激活和蛋白质运输中起了关键作用；蛋白激酶Akt的K63链泛素化，对于Akt的膜定位和磷酸化很重要[12-14]。此外，K48位的泛素化被证实与蛋白质降解有关[15]。而其他赖氨酸连接的多聚泛素链具有非泛素降解和泛素降解功能，其中K63连接多聚泛素化具有非泛素降解功能。已发现泛素化介导的非蛋白降解功能包括DNA损伤修复、信号传导、转录调节、胞吞作用和蛋白激酶活化。
结合本研究结果以及已有文献报道，可推测K63位非降解功能的泛素化影响STAT3蛋白的磷酸化，从而影响STAT3的活性及功能的发挥；而K48位降解功能的泛素化影响STAT3蛋白的降解，使STAT3蛋白得以更新，这2种类型的泛素化对于STAT3蛋白及其功能都十分重要。
参考文献：
[1]Levy D E，Kessler D S，Pine R，et al. Interferon-induced nuclear factors that bind a shared promoter element correlate with positive and negative transcriptional control[J]. Genes
关键词：STAT3蛋白；表达载体；泛素化；K63；K48
中图分类号： Q78文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）11-0016-03
化[5]。信号转导与转录激活因子家族（STAT）已发现7个成员，STAT3是该家族的研究热点，且敲除该基因可以使胚胎死亡，说明该基因是不可或缺的。磷酸化修饰是调控STAT3活性的主要方式，Tyr705、Ser727是磷酸化的关键氨基酸位点[6]。此外，STAT3的Lys685可以在组蛋白乙酰转移酶的修饰下发生可逆乙酰化[7-8]。
在真核细胞中，蛋白质的泛素化和磷酸化是最常见的翻译后修饰。细胞外信号严格调控着蛋白的泛素化，在很多情况下，这种调控依赖于蛋白质的磷酸化[9]。磷酸化通过修饰泛素化的底物，或者修饰泛素化机器的某个组分来影响泛素化。此外，泛素化对于磷酸化和信号分子的传递也有一定的作用。本研究通过研究STAT3蛋白是否会发生泛素化，发生哪种类型的泛素化，并以此解释泛素化与STAT3活性之间的关系。
1材料与方法
1.1试验材料
Taq DNA polymerase，购自北京鼎国生物技术有限公司；T4 DNA连接酶、pMD-19-T simple Vector、DNA酶Ⅰ、Oligo（dT）18、Random promers、PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）Kit，购自TaKaRa公司；dNTPs，购自北京盛旭百川生物科技有限公司；DNA分子量标准品，购自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；蛋白质非预染分子量标准marker及预染分子量标准marker，购自Fermentas公司；Tween-20，购自Amresco公司；质粒小量提取试剂盒、EASYspin plus RNA提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；质粒大量提取试剂盒、Enhanced chemiluminescence（ECL）kit，购自北京康为世纪生物科技有限公司；DNA凝胶回收纯化试剂盒，购自Zymo公司；无内毒素大量质粒提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；Anti-c-HA单克隆抗体、protein A/G plus-agarose（SC-2003），购自Santa Cruz生物公司；Anti-FLAG M2（F1804）单克隆抗体、PI染料，购自Sigma公司；HRP-标记山羊抗小鼠和山羊抗兔抗體，购自北京鼎国生物技术有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂，购自Invitrogen公司；蛋白酶抑制剂，购自亚太恒信生物科技（北京）有限公司；Sal Ⅰ和Hind Ⅲ酶，购自NEB公司；HA-ub、HA-KO、HA-K48、HA-K63等载体质粒均由唐军教授馈赠；所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.2Human STAT3基因的克隆
根据NCBI STAT3（ID：47080104）基因序列设计引物，上游引物为5′-ATGGCCCAATGGAATCAGC-3′，下游引物为5′-TCACATGGGGGAGGTAGCGC-3′。建立50 μL PCR反应体系：5 μL 10×PCR Buffer，2 μL 10 mmol/L dNTPs，20 pmol/L 上下游引物各1 μL，4 μL cDNA，1 μL Taq plus DNA polymerase，用ddH2O补至50 μL。按以下程序进行PCR反应：94 ℃预变性5 min，进入循环：94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸2.5 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物，目的基因大小为 2 313 bp。
1.3宿主细胞蛋白STAT3重组质粒的构建
针对pRK5-flag质粒多克隆位点设计引物并引入SalⅠ和HindⅢ酶切位点，以测序正确的pMD-19-T-STAT3质粒为模板进行PCR；1.5%琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物后，进行SalⅠ和HindⅢ双酶切，同时对pRK5-flag质粒进行 SalⅠ 和HindⅢ双酶切，1.0%琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物；将PCR酶切产物和pRK5-flag酶切产物按6 ∶1摩尔比混合，并加入等量的（5 μL）Solution I（酶溶液），过夜连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α；挑取单克隆，提取质粒酶切鉴定正确后，由北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，测序正确克隆保存菌种，并提取质粒待用。
pRK5-flag-STAT3：上下游引物分别引入SalⅠ和HindⅢ酶切位点，上游引物为5′-ACGCGTCGACATGGCCCAATGGAATCAGCTAC-3′，下游引物为5′-CCCAAGCTTTCACATGGGGGAGGTAGCGCAC-3′。
1.4STAT3泛素化的检测
6孔板分别按下述方式转染HEK293T细胞，其中pRK5-flag空载体组作为阴性对照：（1）pRK5-flag HA-ub；（2）pRK5-flag-STAT3 HA-ub；（3）pRK5-flag HA-KO；（4）pRK5-flag-STAT3 HA-K48；（5）pRK5-flag-STAT3 HA-K63。 细胞内泛素化：（1）质粒转染后20 h（即收获细胞蛋白前4 h），加入20 μmol/L MG132抑制蛋白酶体的降解作用。（2）收获细胞蛋白。用冰预冷的1×PBS轻轻漂洗细胞2次。（3）配制裂解工作液。1 mL Lysis buffer中加入10 μmol/L二硫苏糖醇溶液，1×cocktail C蛋白酶抑制，10 mmol/L N-乙基顺丁烯二酰亚胺和终浓度为1%的十二烷基硫酸钠溶液（SDS）。（4）6孔板每个孔中加入80 μL现用现配的裂解工作液，将细胞刮下转移至1.5 mL的离心管中。（5）将离心管放入 95 ℃ 金属浴中，灭活10 min。（6）超声波（功率10%）破碎细胞沉淀1 min。（7）每管加入720 μL不含（SDS）的裂解工作液，4 ℃、12 000 r/min离心20 min。（8）取出50 μL离心上清液作为Input，其余上清液加入到含有偶联Flag抗体的beads离心管中，4 ℃旋转孵育过夜。（9）过夜孵育之后，用 1×Lysis buffer洗涤beads 3次（4 ℃、3 000 r/min、3 min）。（10）加入20 μL 2×SDS蛋白上样缓冲液，于100 ℃煮 10 min，立即进行Western Blot检测。
2结果与分析
2.1人源STAT3基因的克隆
为获取人源基因STAT3，使用Trizol法提取HEK293T细胞的总RNA，以其为模板利用RT-PCR扩增STAT3基因。扩增得到片段大小约为2 310 bp，如图1所示。随后将2种PCR产物分别与pMD-19-T载体连接，并将转化后长出的阳性克隆进行测序。测序结果表明，构建并保存在pMD-19-T载体中的STAT3基因与NCBI上登陆的参考序列在氨基酸水平上完全相同，可用于后续试验中。
2.2STAT3基因重组载体的构建
根据试验需要，将STAT3基因分别插入相应的表达载体内，经双酶切鉴定及测序比对正确后作质粒大量提取，用于后续的试验。依据试验需求构建重组载体pRK5-flag-STAT3，重组载体的酶切鉴定结果如图2所示。
2.3pRK5-flag-STAT3質粒的验证表达
将pRK5-flag-STAT3质粒转染入HEK293T细胞，转染24 h后收获细胞蛋白，进行Western Blot验证。如图3所示，pRK5-flag-STAT3在细胞中表达良好，可以用于后续试验。
2.4STAT3蛋白可以发生泛素化
为验证STAT3蛋白能否发生泛素化修饰，将构建的pRK5-flag-STAT3真核表达载体以及pRK5-flag与 HA-ub 一起转染HEK293T细胞，为保证能有效捕捉蛋白泛素化修饰，在转染20 h后收集细胞裂解液，并进行免疫共沉淀，孵育2 h后，进行Western Blot检测，如图4所示，STAT3可以发生泛素化修饰。
2.5STAT3蛋白泛素化类型确定
泛素分子全长包含7个赖氨酸位点（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）和1个位于C端的甘氨酸位点以及位于N端的甲硫氨酸位点。泛素自身的每个赖氨酸位点以及N端的
甲硫氨酸位点都可以发生泛素化从而延伸泛素链[10-11]，其中对K48、K63位多聚泛素化的研究最广泛。按照试验方法中所述，将构建的pRK5-flag-STAT3真核表达载体以及pRK5-flag分别与HA-ub、HA-KO、HA-K48、HA-K48一起转染HEK293T细胞，在转染20 h后收集细胞裂解液，并进行免疫共沉淀，孵育2 h后，进行Western Blot检测，如图5所示，STAT3可以发生多种类型的泛素化修饰。
3结果与讨论
STAT3蛋白作为信号通路中一个关键的分子，在受到外界信号刺激时，会发生磷酸化和二聚体化，转化为活性形式的pSTAT3，进入细胞核发挥转录激活的作用。
本研究通过克隆的方法获得了人源STAT3基因，并将其构建在pRK5-flag表达载体上。之后将pRK5-flag-STAT3和泛素质粒共转染细胞，确认STAT3可以发生泛素化修饰，并可以发生Ko、K48、K63等多种类型的泛素化。已有研究报道K63位的泛素化中在信号激活和蛋白质运输中起了关键作用；蛋白激酶Akt的K63链泛素化，对于Akt的膜定位和磷酸化很重要[12-14]。此外，K48位的泛素化被证实与蛋白质降解有关[15]。而其他赖氨酸连接的多聚泛素链具有非泛素降解和泛素降解功能，其中K63连接多聚泛素化具有非泛素降解功能。已发现泛素化介导的非蛋白降解功能包括DNA损伤修复、信号传导、转录调节、胞吞作用和蛋白激酶活化。
结合本研究结果以及已有文献报道，可推测K63位非降解功能的泛素化影响STAT3蛋白的磷酸化，从而影响STAT3的活性及功能的发挥；而K48位降解功能的泛素化影响STAT3蛋白的降解，使STAT3蛋白得以更新，这2种类型的泛素化对于STAT3蛋白及其功能都十分重要。
参考文献：
[1]Levy D E，Kessler D S，Pine R，et al. Interferon-induced nuclear factors that bind a shared promoter element correlate with positive and negative transcriptional control[J]. Genes