论文部分内容阅读
摘 要 通过对实验室已获得的1 685个橡胶炭疽病菌T-DNA插入突变体的生物学及致病性测定，从中筛选出15个致病力明显减弱的突变体，并进行PCR检测。结果表明，该基因组中均含潮霉素磷酸转移酶基因片段。在PDA培养基上，其中2个突变体菌落颜色异常，6个生长速率下降，8个产孢量显著降低，2个突变体分生孢子形态异常，2个附着胞形态异常，3个不能形成附着胞，在洋葱表皮上，侵染钉形成率显著降低。
关键词 胶胞炭疽病菌；突变体；表型分析
中图分类号 S794.1 文献标识码 A
Abstract To use the promoter trapping vector pCAHPH， constructed by our lab， via Agrobacterium tumifaciens-mediated transformation（ATMT）of Colletotrichum gloeosporioides， an expansion library of 1 685 transformants resisting to hygromycin B was generated. The 15 transformants which reduced greatly in pathogenicity were selected for identification. The mutants were tested with PCR for the insertional sequence. The results showed that all the genomes of the mutants contained the sequence of hph gene. As to the observation of the biological properties of the mutants， it was found that 2 mutants had abnormal color， the colonies of 6 growed slowly， the sporulation of 8 was significantly reduced， the conidium morphology of 2 was abnormal， the appressoria of 2 was abnormal and 3 could not form any appressoria. The formation rate of infection peg decreased significantly in the onion skin cell.
Key words Colletotrichum gloeosporioides； Mutants； Phenotype analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.030
炭疽病是橡胶树重要病害之一，可由胶胞炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）或尖孢炭疽病菌（Colletorichum acutatum）引起，导致橡胶树叶片组织坏死或大量脱落，树体衰弱，从而缩短割胶期限，最终造成橡胶总产量显著下降。中国每年受害面积在20 000 hm2以上，造成干胶损失近万吨[1-2]。其中胶胞炭疽病菌具有寄主范围广、繁殖速度快等特点，因此，其引起的病害流行速度快，难于防治。
对于炭疽病的遗传转化，李伟等[3-4]建立了根癌农杆菌介导的胶孢炭疽菌遗传转化体系；魏小慧等[5-6]进行了橡胶炭疽病菌启动子捕获体系的建立，本研究则利用魏小慧建立的体系，进行了突变体库的构建，至今获得4 547个转化子。李继锋等[7]和蔡志英等[8]对橡胶树炭疽病菌T-DNA插入突变体库的构建进行了研究，并对其致病缺陷转化子进行筛选；胡彩平等[9]对柱花草炭疽病菌进行了转化体系的优化研究。本研究通过致病性的测定从突变体库中的1 685个突变体中筛选出15个致病性相关突变体，对这15个突变体的生物学特性及致病性进一步进行测定，明确致病性与生物学特性之间的联系，为充分理解突变体致病性丧失的机制和快捷、有效地分离、鉴定橡胶炭疽病菌致病相关基因奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 橡胶胶孢炭疽病菌RC-178菌株由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带特色经济作物病害课题组提供，该菌株分离自云南具有炭疽病症状典型的橡胶叶片病斑，具有极强的侵染性和产孢能力。本实验室前期已构建了基于野生型菌株RC-178的T-DNA插入突变体库，RC-178和突变体菌株均经单孢分离和纯化后用纸片法保存于-20 ℃冰箱中。用于筛选致病力丧失突变体的接种材料为健康的热研7-33-97橡胶树渐退去古铜色的幼嫩叶片。
1.1.2 培养基 用PDA固体培养基培养炭疽菌产生分生孢子、测定生长速度等，用PDA液体培养基大量培养炭疽菌菌丝。
1.1.3 抗生素及试剂 潮霉素B（HygromycinB）购自德国Roche公司；卡那霉素（Kanamycin）、利福平（Rifampicin）、头孢霉素（Cefotaxime）、四环素（Tetracyline）和链霉素（Streptomycin）等均购自Sigma公司；Taq DNA聚合酶购自TaKaRa大连公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 致病相关突变体的筛选 参照李琳[10]的方法，采用健康的幼嫩叶片进行离体接种。在35 cm×45 cm的白色磁盘中铺2层吸水纸，用水湿透，将嫩叶放在吸水纸上，喷洒水雾于叶片上，叶柄用湿润的滤纸包住保湿，刺伤半边叶片，用打孔器取相同大小的菌块在叶表面伤口处接种，保鲜膜包住白瓷盘保湿，以刺伤叶片接种同样大小的无菌PDA培养基为对照。实验重复3次。48 h后观察接种叶片感染情况，以接种点出现水渍状变色认定为已被侵染。3 d后开始观察发病情况，7 d后进行病害严重度分级。 1.2.2 突变体DNA提取及T-DNA插入的分子检测
将RC-178菌株和突变体移接于PDA平板上，28 ℃培养，7 d后收集分生孢子和菌丝，并将其转入PDA液体培养基中，180 r/min，28 ℃振荡培养3 d，待菌液中出现丰富的菌丝体时，过滤收集菌丝体，于40 ℃烘箱内干燥1 d，备用。参照崔昌华[2]的方法，用CTAB法提取各参试菌株的DNA。
1.2.3 突变体的生物学特性研究 观察筛选出的致病性改变突变体单孢分离物形态特征和生长发育过程，记录菌落颜色、直径、产孢量、孢子萌发率、附着胞形态和侵染钉形成等情况。
（1）菌落生长速率及形态的观察。用灭菌镊子夹取保存在纸袋中的15个突变体及RC178的附带菌丝纸片，置于PDA培养基上，28 ℃恒温培养5 d后，用打孔器分别打取直径为0.5 cm的菌饼，并接种于直径9 cm平皿的PDA平板中央， 28 ℃恒温培养，8 d后测量菌落直径，并记录菌落的颜色。
（2）分生孢子形态及产孢量的比较。在PDA培养基上培养7 d后，用无菌三角玻棒刮除菌丝。置于日光灯下连续光照培养3 d。在平板上按十字交叉法划线，沿等分线用直径为0.6 cm打孔器打取8块菌饼，将所有菌饼放置于盛有4 mL灭菌水的试管中，用玻璃棒搅拌将孢子刮洗下来，从试管中取孢子悬浮液在显微镜下用血球计数板计算孢子数目，描述分生孢子形态及计算产孢量。
（3）孢子萌发和附着胞的观察。将分生孢子悬浮液浓度调节到1.0×105个/mL，滴在干净的载玻片上，以湿润棉花在周围保湿，放置于吸水饱和的滤纸上，于4、8、12、24 h各观察1次。
（4）侵染钉形成的观察。取新鲜洋葱第2层和第3层内表皮，分割成1 cm×1 cm小块，外侧向上贴在吸水饱和的滤纸上，置于直径9 cm的培养皿中，每皿放8～10块。将RC-178和突变体分生孢子悬浮液浓度调节成4.0×104 个/mL，喷雾或点滴于洋葱表皮上，每个菌株接7皿。25 ℃黑暗保湿培养，并分别于第8、12、18、24、36、48、72小时各取出1皿，在显微镜下观察孢子萌发和侵染钉形成情况。以上实验均重复3次。
1.3 数据分析
测定数据用SAS软件进行处理与分析。
2.2 T-DNA的PCR检测
从15个转化子和含有载体质粒AGL-PT的PCR检测结果发现均可扩增到约800 bp的潮霉素片段，而阴性对照野生型菌株RC-178没有任何条带（图1）。表明参试的突变体基因组中确实插入了潮霉素磷酸转移酶基因的序列。
2.3 胶胞炭疽菌致病性相关突变体生物学特性分析
对RC-178及15个致病性相关突变体进行生长速率、产孢量，分生孢子萌发率及附着胞形成率测定，并采用数据分析系统软件进行差异显著性分析。
2.3.1 致病性相关突变体生长速率测定及菌落形态观察 由表1可以看出，有6个致病力相关突变体T-0003-3、T-0078-1、T-0261-3、T-0695-1、T-0900-1、T-1103-2的菌落生长速率明显低于RC-178，分别为0.49、0.51、0.47、0.61、0.50、0.43 cm/d。方差分析结果显示，这6个突变体与野生型RC-178菌株生长速度均存在明显的差异显著性，由此推测，菌落生长速率的减弱可能是由于T-DNA插入导致突变体代谢紊乱造成的。
突变体的菌落形态及颜色与野生型RC-178菌株相比也有不同程度的差异，突变体T-0161-2菌丝呈青绿色，T-1103-2菌丝呈青灰色，而RC-178气生菌丝白色且随着菌丝的不断生长逐渐变成黑色（图2）。部分突变体气生菌丝白色、稀薄且有自噬现象，培养过程中能分泌黄褐色代谢物。
2.3.2 产孢量及分生孢子形态 橡胶炭疽菌主要是通过分生孢子侵染并危害橡胶树，因此，产孢量的多少及形态变异势必对其致病性起着举足轻重影响。从表2可见，T-0990-1、T-0161-2、T-0258-2、T-1103-2产孢量与RC-178产孢量差异不显著；T-0003-3、T-0129-1、T-1580-1、T-0019-1、T-0010-1、T-0005-3、T-0058-1、T-0695-1这8个突变体产孢量均显著低于RC-178菌株，其中，T-0003-3和T-0695-1未见产生分生孢子，方差分析结果显示，6个突变体与野生型炭疽菌RC-178在产孢能力上存在极显著差异。
通过显微镜观察并对分生孢子大小进行测量发现（表2），突变体分生孢子形态与RC-178相比，也均存在变异。野生型RC-178菌株分生孢子大小为（14.41±0.34）μm×（4.03±0.07）μm，长柱型或长圆型，表面光滑，两端钝圆。而突变体分生孢子均显短粗，呈椭圆形或短棍棒形。方差分析结果显示，15个突变体分生孢子长度与野生型RC-178均差异显著，而突变体T-0258-2、T-0078-1、T-1580-1和T-0058-1分生孢子在宽度上与野生型RC-178无明显差异。
2.3.3 分生孢子萌发及附着胞、侵染钉形成观察
分生孢子萌发及附着胞形成是炭疽菌侵染寄主过程中非常关键的一步，分生孢子萌发产生附着胞才有可能再分化出一系列侵染结构侵染寄主，因此较低的萌发率或者附着胞形成率同样可能是致病性降低或者丧失的原因之一。笔者统计了不同菌株的萌发率及附着胞形成率（表3、图3）。结果表明，除T-0078-1孢子萌发率（84%）及附着胞形成率（75%）与野生型RC-178相似，无显著差异外，其余14个突变体均较低，而且萌发率和附着胞形成率与野生型RC-178相比均存在显著差异。突变体T-0900-1、T-0258-2、T-0129-1、T-1580-1、T-0019-1、T-0010-1、T-0005-3和T-0058-1的孢子萌发率及附着胞形成率均在15%～62%之间，而T-0990-1、T-0261-3及T-0161-2的分生孢子萌发率仅为2%，远远低于野生型菌株RC-178，其中，突变体T-0990-1和T-0161-2分生孢子仅1%可以产生附着胞，而突变体T-0261-3在整个孢子萌发实验中未见任何附着胞产生，很可能是其无致病性的机理之一，有待进一步验证。 在对侵染钉形成情况观察过程中发现，15个突变体侵染钉形成率均低于野生型RC-178，与附着胞形成率相似。
3 讨论与结论
本研究中，大部分致病性相关突变体在菌落生长速度方面与野生型RC-178差异不显著，其中8个突变体在产孢量方面均显著低于野生型RC-178，而且菌落形态和分生孢子形态也有一些变异。同时，尽管T-0078-1与野生型RC-178萌发率及附着胞形成率相似，但T-0078-1的产孢量却不到野生型RC-178的1%，从而使附着胞形成量的绝对值仍然显著低于野生型。其它突变体分生孢子萌发率及附着胞形成率均明显比野生型RC-178低，其中T-0990-1、T-0261-3和T-0161-2几乎不能萌发产生附着胞。这些生物学特性方面的变异，可能直接影响其对寄主的侵染，与Kim和Takano的研究结果类似[11-12]。由此推测，致病性相关突变体致病性丧失可能导致部分生物学特性产生变化，但仍需要从分子细胞学及分子生物学方面进行研究加以验证。
在丝状真菌功能基因组研究中，通过插入突变法（ATMT）获得突变体，鉴定突变体表型的变异，分析突变体的基因改变，从而可以了解基因功能[13]。ATMT是其中常用的方法之一，ATMT方法获得的无致病性突变体的致病性丧失可能是由于T-DNA随机插入至关键基因造成的[14]。这种致病性的丧失通常也会表现为各种生物学特性的变异，如产孢量减少，萌发率降低，不能产生附着胞或附着胞不能黑色化等[15-17]。如分离自胶胞炭疽菌无致病性突变体中的cap20基因[18]，就是通过对附着胞形成机制的调控而影响其致病性的。无致病性突变体的深入研究将可能获得植物与病原菌之间相互作用的有用信息，为致病机理的研究提供理论依据。近年来，研究人员根据T-DNA插入标记己经成功地从多种炭疽菌无致病性突变体中获得致病相关基因，如CLTAl[19]、PKSI[20]、CPR1[21]、CgDN3[22]等。
突变体的遗传稳定性是突变深入研究的基础，是相关功能基因克隆及分析有效性的前提，同时也是进行基因功能研究的有力保障。在本实验的研究结果中，15个致病性相关突变体在生物学特性及致病性方面均表现出良好的遗传稳定性，为后续的致病分子机理研究提供实验材料。下一步将运用 TAIL-PCR技术克隆转化子T-DNA侧翼序列， 利用Southern杂交证实T-DNA插入拷贝数；同时，借助本研究室已开展的胶胞炭疽菌基因组序列的测定，开展相关基因的克隆与功能分析。
参考文献
[1] 郑肖兰， 崔昌华， 郑服丛， 等. 橡胶炭疽病病原菌生物学特性初步研究[J]. 微生物学通报， 2006， 33（2）： 95-99.
[2] 崔昌华， 郑肖兰， 刘洪平， 等. 橡胶树炭疽菌rDNA-ITS区序列分析研究[J]. 热带作物学报， 2007， 27（4）： 41-45.
[3] 李 伟. 芒果胶孢炭疽病菌遗传转化体系的建立[D]. 儋州： 华南热带农业大学， 2004.
[4] 李 伟， 郑肖兰， 贺春萍， 等. 根癌农杆菌介导的胶孢炭疽菌遗传转化体系的建立[J]. 植物保护， 2008， 34（1）： 76-81.
[5] 魏小慧. 橡胶炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）启动子捕获体系的建立[D]. 海口： 海南大学， 2009.
[6] 魏小慧， 林春花， 郑肖兰， 等.利用启动子捕获技术构建橡胶炭疽病菌突变体库[J]. 热带作物学报， 2009， 30（6）： 804-810.
[7] 李继锋. 橡胶树炭疽病菌T-DNA插入突变体库的构建及其分子研究[D]. 海口： 海南大学， 2010.
[8] 蔡志英， 林春花， 时 涛， 等. 胶树胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库构建及其致病缺陷转化子筛选[J]. 微生物学通报， 2012， 39（6）： 773-780.
[9] 胡彩平， 郑金龙， 高建明， 等. 根癌农杆菌介导柱花草炭疽菌遗传转化体系的优化[J]. 热带作物学报， 2013， 34（6）： 1 007-1 012.
[10] 李 琳， 崔昌华， 郑肖兰， 等. 海南岛橡胶炭疽菌基础生物学特性研究[J]， 热带农业科学， 2007， 27（2）： 6-9.
[11] Kim Y K， Wang Y H， Liu Z M， et al. Identification of a hard surface contact-induced gene in Colletotrichum gloeosporioides conidia as a sterol glycosyl transferase， a novel fungal virulence factor[J]. The Plant Journal， 2002， 30： 177-187.
[12] Takano Y， Kubo Y， Shimizu K， et al. Structural analysis of PKSI， a polyketide synthase gene involved in melanin biosynthesis of Colletotrichum lagenarium[J]. Molecular General Genetics， 1995， 249： 162-167.
[13] 黄贵修， 薛迎春， 卢 昕. 胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建及其分子分析[J]. 热带作物学报， 2008， 29（1）： 27-32.
[14] 黄亚丽， 潘 玮， 蒋细良， 等.根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展[J]. 生物技术通报， 2007（3）： 111-114. [15] Huang G， Zhang L and Birch R G. Rapid amplification and cloning of Tn5 flanking fragments by inverse PCR[J]. Letter in Applied Microbiology， 2000， 31： 149-153.
[16] Huang S H， Hu Y Y， Wu C H， et al. A simple method for direct cloning cDNA sequence that flanks a region of known sequence from total RNA by applying the inverse polymerase chain reaction[J]. Nucleic Acids Research， 1990， 18： 1 922.
[17] Ben J D， Jan W M， Peter A H M， et al. Siderophore-mediated competition for iron and induced resistance in the suppression of fusarium wilt of carnation by fluorescent Pseudomonas spp. Neth[J]. J Plant Pathol， 1993， 99： 277-289.
[18] Hwang C S and Kolattukudy P E. Isolation and characterization of genes expressed uniquely during appressorium formation by Colletotrichum gloeosporioides conidia induced by the host surface wax. Molecular and General Genetics， 1995， 247： 282-294.
[19] Dufresne M， Perfect S， Pellier A L， Bailey J A and Langin T. A GAL4-like protein is involved in the switch between biotrophic and necrotrophic phases of the infection process of Colletotrichum lindemuthianum on Common Bean[J]. The Plant Cell， 2000， 12： 1 579-1 589.
[20] Tsuji G， Fujii S， Tsuge S， et al. The Colletotrichum lagenarium Ste12-Like gene CSTl is essential for appressorium penetration[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2003， 16： 315-325.
[21] Thon M R， Nuckles E M， Takach J E， et al. CPRl： A gene encoding a putative signal peptidase that functions in pathogenicity of Colletotrichum graminicola to maize[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2002， 15： 120-128.
[22] Stephenson S A， Hatfield J， Rusu A G， et al. CgDN3： An essential pathogenicity gene of Colletotrichum gloeosporioides necessary to avert a hypersensitive-like response in the host stylosanthes guianensis[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2000， 13： 929-941.
关键词 胶胞炭疽病菌；突变体；表型分析
中图分类号 S794.1 文献标识码 A
Abstract To use the promoter trapping vector pCAHPH， constructed by our lab， via Agrobacterium tumifaciens-mediated transformation（ATMT）of Colletotrichum gloeosporioides， an expansion library of 1 685 transformants resisting to hygromycin B was generated. The 15 transformants which reduced greatly in pathogenicity were selected for identification. The mutants were tested with PCR for the insertional sequence. The results showed that all the genomes of the mutants contained the sequence of hph gene. As to the observation of the biological properties of the mutants， it was found that 2 mutants had abnormal color， the colonies of 6 growed slowly， the sporulation of 8 was significantly reduced， the conidium morphology of 2 was abnormal， the appressoria of 2 was abnormal and 3 could not form any appressoria. The formation rate of infection peg decreased significantly in the onion skin cell.
Key words Colletotrichum gloeosporioides； Mutants； Phenotype analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.030
炭疽病是橡胶树重要病害之一，可由胶胞炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）或尖孢炭疽病菌（Colletorichum acutatum）引起，导致橡胶树叶片组织坏死或大量脱落，树体衰弱，从而缩短割胶期限，最终造成橡胶总产量显著下降。中国每年受害面积在20 000 hm2以上，造成干胶损失近万吨[1-2]。其中胶胞炭疽病菌具有寄主范围广、繁殖速度快等特点，因此，其引起的病害流行速度快，难于防治。
对于炭疽病的遗传转化，李伟等[3-4]建立了根癌农杆菌介导的胶孢炭疽菌遗传转化体系；魏小慧等[5-6]进行了橡胶炭疽病菌启动子捕获体系的建立，本研究则利用魏小慧建立的体系，进行了突变体库的构建，至今获得4 547个转化子。李继锋等[7]和蔡志英等[8]对橡胶树炭疽病菌T-DNA插入突变体库的构建进行了研究，并对其致病缺陷转化子进行筛选；胡彩平等[9]对柱花草炭疽病菌进行了转化体系的优化研究。本研究通过致病性的测定从突变体库中的1 685个突变体中筛选出15个致病性相关突变体，对这15个突变体的生物学特性及致病性进一步进行测定，明确致病性与生物学特性之间的联系，为充分理解突变体致病性丧失的机制和快捷、有效地分离、鉴定橡胶炭疽病菌致病相关基因奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 橡胶胶孢炭疽病菌RC-178菌株由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带特色经济作物病害课题组提供，该菌株分离自云南具有炭疽病症状典型的橡胶叶片病斑，具有极强的侵染性和产孢能力。本实验室前期已构建了基于野生型菌株RC-178的T-DNA插入突变体库，RC-178和突变体菌株均经单孢分离和纯化后用纸片法保存于-20 ℃冰箱中。用于筛选致病力丧失突变体的接种材料为健康的热研7-33-97橡胶树渐退去古铜色的幼嫩叶片。
1.1.2 培养基 用PDA固体培养基培养炭疽菌产生分生孢子、测定生长速度等，用PDA液体培养基大量培养炭疽菌菌丝。
1.1.3 抗生素及试剂 潮霉素B（HygromycinB）购自德国Roche公司；卡那霉素（Kanamycin）、利福平（Rifampicin）、头孢霉素（Cefotaxime）、四环素（Tetracyline）和链霉素（Streptomycin）等均购自Sigma公司；Taq DNA聚合酶购自TaKaRa大连公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 致病相关突变体的筛选 参照李琳[10]的方法，采用健康的幼嫩叶片进行离体接种。在35 cm×45 cm的白色磁盘中铺2层吸水纸，用水湿透，将嫩叶放在吸水纸上，喷洒水雾于叶片上，叶柄用湿润的滤纸包住保湿，刺伤半边叶片，用打孔器取相同大小的菌块在叶表面伤口处接种，保鲜膜包住白瓷盘保湿，以刺伤叶片接种同样大小的无菌PDA培养基为对照。实验重复3次。48 h后观察接种叶片感染情况，以接种点出现水渍状变色认定为已被侵染。3 d后开始观察发病情况，7 d后进行病害严重度分级。 1.2.2 突变体DNA提取及T-DNA插入的分子检测
将RC-178菌株和突变体移接于PDA平板上，28 ℃培养，7 d后收集分生孢子和菌丝，并将其转入PDA液体培养基中，180 r/min，28 ℃振荡培养3 d，待菌液中出现丰富的菌丝体时，过滤收集菌丝体，于40 ℃烘箱内干燥1 d，备用。参照崔昌华[2]的方法，用CTAB法提取各参试菌株的DNA。
1.2.3 突变体的生物学特性研究 观察筛选出的致病性改变突变体单孢分离物形态特征和生长发育过程，记录菌落颜色、直径、产孢量、孢子萌发率、附着胞形态和侵染钉形成等情况。
（1）菌落生长速率及形态的观察。用灭菌镊子夹取保存在纸袋中的15个突变体及RC178的附带菌丝纸片，置于PDA培养基上，28 ℃恒温培养5 d后，用打孔器分别打取直径为0.5 cm的菌饼，并接种于直径9 cm平皿的PDA平板中央， 28 ℃恒温培养，8 d后测量菌落直径，并记录菌落的颜色。
（2）分生孢子形态及产孢量的比较。在PDA培养基上培养7 d后，用无菌三角玻棒刮除菌丝。置于日光灯下连续光照培养3 d。在平板上按十字交叉法划线，沿等分线用直径为0.6 cm打孔器打取8块菌饼，将所有菌饼放置于盛有4 mL灭菌水的试管中，用玻璃棒搅拌将孢子刮洗下来，从试管中取孢子悬浮液在显微镜下用血球计数板计算孢子数目，描述分生孢子形态及计算产孢量。
（3）孢子萌发和附着胞的观察。将分生孢子悬浮液浓度调节到1.0×105个/mL，滴在干净的载玻片上，以湿润棉花在周围保湿，放置于吸水饱和的滤纸上，于4、8、12、24 h各观察1次。
（4）侵染钉形成的观察。取新鲜洋葱第2层和第3层内表皮，分割成1 cm×1 cm小块，外侧向上贴在吸水饱和的滤纸上，置于直径9 cm的培养皿中，每皿放8～10块。将RC-178和突变体分生孢子悬浮液浓度调节成4.0×104 个/mL，喷雾或点滴于洋葱表皮上，每个菌株接7皿。25 ℃黑暗保湿培养，并分别于第8、12、18、24、36、48、72小时各取出1皿，在显微镜下观察孢子萌发和侵染钉形成情况。以上实验均重复3次。
1.3 数据分析
测定数据用SAS软件进行处理与分析。
2.2 T-DNA的PCR检测
从15个转化子和含有载体质粒AGL-PT的PCR检测结果发现均可扩增到约800 bp的潮霉素片段，而阴性对照野生型菌株RC-178没有任何条带（图1）。表明参试的突变体基因组中确实插入了潮霉素磷酸转移酶基因的序列。
2.3 胶胞炭疽菌致病性相关突变体生物学特性分析
对RC-178及15个致病性相关突变体进行生长速率、产孢量，分生孢子萌发率及附着胞形成率测定，并采用数据分析系统软件进行差异显著性分析。
2.3.1 致病性相关突变体生长速率测定及菌落形态观察 由表1可以看出，有6个致病力相关突变体T-0003-3、T-0078-1、T-0261-3、T-0695-1、T-0900-1、T-1103-2的菌落生长速率明显低于RC-178，分别为0.49、0.51、0.47、0.61、0.50、0.43 cm/d。方差分析结果显示，这6个突变体与野生型RC-178菌株生长速度均存在明显的差异显著性，由此推测，菌落生长速率的减弱可能是由于T-DNA插入导致突变体代谢紊乱造成的。
突变体的菌落形态及颜色与野生型RC-178菌株相比也有不同程度的差异，突变体T-0161-2菌丝呈青绿色，T-1103-2菌丝呈青灰色，而RC-178气生菌丝白色且随着菌丝的不断生长逐渐变成黑色（图2）。部分突变体气生菌丝白色、稀薄且有自噬现象，培养过程中能分泌黄褐色代谢物。
2.3.2 产孢量及分生孢子形态 橡胶炭疽菌主要是通过分生孢子侵染并危害橡胶树，因此，产孢量的多少及形态变异势必对其致病性起着举足轻重影响。从表2可见，T-0990-1、T-0161-2、T-0258-2、T-1103-2产孢量与RC-178产孢量差异不显著；T-0003-3、T-0129-1、T-1580-1、T-0019-1、T-0010-1、T-0005-3、T-0058-1、T-0695-1这8个突变体产孢量均显著低于RC-178菌株，其中，T-0003-3和T-0695-1未见产生分生孢子，方差分析结果显示，6个突变体与野生型炭疽菌RC-178在产孢能力上存在极显著差异。
通过显微镜观察并对分生孢子大小进行测量发现（表2），突变体分生孢子形态与RC-178相比，也均存在变异。野生型RC-178菌株分生孢子大小为（14.41±0.34）μm×（4.03±0.07）μm，长柱型或长圆型，表面光滑，两端钝圆。而突变体分生孢子均显短粗，呈椭圆形或短棍棒形。方差分析结果显示，15个突变体分生孢子长度与野生型RC-178均差异显著，而突变体T-0258-2、T-0078-1、T-1580-1和T-0058-1分生孢子在宽度上与野生型RC-178无明显差异。
2.3.3 分生孢子萌发及附着胞、侵染钉形成观察
分生孢子萌发及附着胞形成是炭疽菌侵染寄主过程中非常关键的一步，分生孢子萌发产生附着胞才有可能再分化出一系列侵染结构侵染寄主，因此较低的萌发率或者附着胞形成率同样可能是致病性降低或者丧失的原因之一。笔者统计了不同菌株的萌发率及附着胞形成率（表3、图3）。结果表明，除T-0078-1孢子萌发率（84%）及附着胞形成率（75%）与野生型RC-178相似，无显著差异外，其余14个突变体均较低，而且萌发率和附着胞形成率与野生型RC-178相比均存在显著差异。突变体T-0900-1、T-0258-2、T-0129-1、T-1580-1、T-0019-1、T-0010-1、T-0005-3和T-0058-1的孢子萌发率及附着胞形成率均在15%～62%之间，而T-0990-1、T-0261-3及T-0161-2的分生孢子萌发率仅为2%，远远低于野生型菌株RC-178，其中，突变体T-0990-1和T-0161-2分生孢子仅1%可以产生附着胞，而突变体T-0261-3在整个孢子萌发实验中未见任何附着胞产生，很可能是其无致病性的机理之一，有待进一步验证。 在对侵染钉形成情况观察过程中发现，15个突变体侵染钉形成率均低于野生型RC-178，与附着胞形成率相似。
3 讨论与结论
本研究中，大部分致病性相关突变体在菌落生长速度方面与野生型RC-178差异不显著，其中8个突变体在产孢量方面均显著低于野生型RC-178，而且菌落形态和分生孢子形态也有一些变异。同时，尽管T-0078-1与野生型RC-178萌发率及附着胞形成率相似，但T-0078-1的产孢量却不到野生型RC-178的1%，从而使附着胞形成量的绝对值仍然显著低于野生型。其它突变体分生孢子萌发率及附着胞形成率均明显比野生型RC-178低，其中T-0990-1、T-0261-3和T-0161-2几乎不能萌发产生附着胞。这些生物学特性方面的变异，可能直接影响其对寄主的侵染，与Kim和Takano的研究结果类似[11-12]。由此推测，致病性相关突变体致病性丧失可能导致部分生物学特性产生变化，但仍需要从分子细胞学及分子生物学方面进行研究加以验证。
在丝状真菌功能基因组研究中，通过插入突变法（ATMT）获得突变体，鉴定突变体表型的变异，分析突变体的基因改变，从而可以了解基因功能[13]。ATMT是其中常用的方法之一，ATMT方法获得的无致病性突变体的致病性丧失可能是由于T-DNA随机插入至关键基因造成的[14]。这种致病性的丧失通常也会表现为各种生物学特性的变异，如产孢量减少，萌发率降低，不能产生附着胞或附着胞不能黑色化等[15-17]。如分离自胶胞炭疽菌无致病性突变体中的cap20基因[18]，就是通过对附着胞形成机制的调控而影响其致病性的。无致病性突变体的深入研究将可能获得植物与病原菌之间相互作用的有用信息，为致病机理的研究提供理论依据。近年来，研究人员根据T-DNA插入标记己经成功地从多种炭疽菌无致病性突变体中获得致病相关基因，如CLTAl[19]、PKSI[20]、CPR1[21]、CgDN3[22]等。
突变体的遗传稳定性是突变深入研究的基础，是相关功能基因克隆及分析有效性的前提，同时也是进行基因功能研究的有力保障。在本实验的研究结果中，15个致病性相关突变体在生物学特性及致病性方面均表现出良好的遗传稳定性，为后续的致病分子机理研究提供实验材料。下一步将运用 TAIL-PCR技术克隆转化子T-DNA侧翼序列， 利用Southern杂交证实T-DNA插入拷贝数；同时，借助本研究室已开展的胶胞炭疽菌基因组序列的测定，开展相关基因的克隆与功能分析。
参考文献
[1] 郑肖兰， 崔昌华， 郑服丛， 等. 橡胶炭疽病病原菌生物学特性初步研究[J]. 微生物学通报， 2006， 33（2）： 95-99.
[2] 崔昌华， 郑肖兰， 刘洪平， 等. 橡胶树炭疽菌rDNA-ITS区序列分析研究[J]. 热带作物学报， 2007， 27（4）： 41-45.
[3] 李 伟. 芒果胶孢炭疽病菌遗传转化体系的建立[D]. 儋州： 华南热带农业大学， 2004.
[4] 李 伟， 郑肖兰， 贺春萍， 等. 根癌农杆菌介导的胶孢炭疽菌遗传转化体系的建立[J]. 植物保护， 2008， 34（1）： 76-81.
[5] 魏小慧. 橡胶炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）启动子捕获体系的建立[D]. 海口： 海南大学， 2009.
[6] 魏小慧， 林春花， 郑肖兰， 等.利用启动子捕获技术构建橡胶炭疽病菌突变体库[J]. 热带作物学报， 2009， 30（6）： 804-810.
[7] 李继锋. 橡胶树炭疽病菌T-DNA插入突变体库的构建及其分子研究[D]. 海口： 海南大学， 2010.
[8] 蔡志英， 林春花， 时 涛， 等. 胶树胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库构建及其致病缺陷转化子筛选[J]. 微生物学通报， 2012， 39（6）： 773-780.
[9] 胡彩平， 郑金龙， 高建明， 等. 根癌农杆菌介导柱花草炭疽菌遗传转化体系的优化[J]. 热带作物学报， 2013， 34（6）： 1 007-1 012.
[10] 李 琳， 崔昌华， 郑肖兰， 等. 海南岛橡胶炭疽菌基础生物学特性研究[J]， 热带农业科学， 2007， 27（2）： 6-9.
[11] Kim Y K， Wang Y H， Liu Z M， et al. Identification of a hard surface contact-induced gene in Colletotrichum gloeosporioides conidia as a sterol glycosyl transferase， a novel fungal virulence factor[J]. The Plant Journal， 2002， 30： 177-187.
[12] Takano Y， Kubo Y， Shimizu K， et al. Structural analysis of PKSI， a polyketide synthase gene involved in melanin biosynthesis of Colletotrichum lagenarium[J]. Molecular General Genetics， 1995， 249： 162-167.
[13] 黄贵修， 薛迎春， 卢 昕. 胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建及其分子分析[J]. 热带作物学报， 2008， 29（1）： 27-32.
[14] 黄亚丽， 潘 玮， 蒋细良， 等.根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展[J]. 生物技术通报， 2007（3）： 111-114. [15] Huang G， Zhang L and Birch R G. Rapid amplification and cloning of Tn5 flanking fragments by inverse PCR[J]. Letter in Applied Microbiology， 2000， 31： 149-153.
[16] Huang S H， Hu Y Y， Wu C H， et al. A simple method for direct cloning cDNA sequence that flanks a region of known sequence from total RNA by applying the inverse polymerase chain reaction[J]. Nucleic Acids Research， 1990， 18： 1 922.
[17] Ben J D， Jan W M， Peter A H M， et al. Siderophore-mediated competition for iron and induced resistance in the suppression of fusarium wilt of carnation by fluorescent Pseudomonas spp. Neth[J]. J Plant Pathol， 1993， 99： 277-289.
[18] Hwang C S and Kolattukudy P E. Isolation and characterization of genes expressed uniquely during appressorium formation by Colletotrichum gloeosporioides conidia induced by the host surface wax. Molecular and General Genetics， 1995， 247： 282-294.
[19] Dufresne M， Perfect S， Pellier A L， Bailey J A and Langin T. A GAL4-like protein is involved in the switch between biotrophic and necrotrophic phases of the infection process of Colletotrichum lindemuthianum on Common Bean[J]. The Plant Cell， 2000， 12： 1 579-1 589.
[20] Tsuji G， Fujii S， Tsuge S， et al. The Colletotrichum lagenarium Ste12-Like gene CSTl is essential for appressorium penetration[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2003， 16： 315-325.
[21] Thon M R， Nuckles E M， Takach J E， et al. CPRl： A gene encoding a putative signal peptidase that functions in pathogenicity of Colletotrichum graminicola to maize[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2002， 15： 120-128.
[22] Stephenson S A， Hatfield J， Rusu A G， et al. CgDN3： An essential pathogenicity gene of Colletotrichum gloeosporioides necessary to avert a hypersensitive-like response in the host stylosanthes guianensis[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2000， 13： 929-941.