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摘 要：目的：初步探讨“葵龙草”注射液的体内外抗肿瘤作用。方法：以人肿瘤细胞株为模型，采用SRB方法检测观察“葵龙草”注射液对多种肿瘤细胞的增殖抑制作用;以H22、S180、HepA、BGC823为模型，以不同剂量的“葵龙草”注射液作用于肿瘤裸小鼠模型，观察“葵龙草”注射液的体内抗肿瘤作用。结果：“葵龙草”注射液对人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MDAMB231、人肝癌细胞HepG2、人结肠癌细胞HCT116、人皮肤鳞状细胞癌细胞A431的增殖有明显的抑制作用，对裸鼠移植S180、H22、HepA、BGC823细胞的增殖也有一定的抑制作用。结论：“葵龙草”注射液能够有效抑制培养的肿瘤细胞生长，注射给药后对多种细胞肿瘤移植的模型小鼠肿瘤增殖有明显的抑制作用，具有较广阔的研究前景。
关键词：“葵龙草”注射液;肿瘤细胞;细胞增殖;抗肿瘤作用
中图分类号：R932 文献标识码：A
Antitumor effects of“Kui long grass”both in vivo and in vitro
Luo Jiaojiao Zhu Ting Zhao Ning* Li Weize Wang Xiaoning
College of Pharmaceutical Science Xi’an Medical University ShaanxiXi’an 710021
Abstract：Objective：To investigate the antitumor effects of“Kui long grass"injection both in vivo and in vitro.Methods：The human tumor cell lines as a model，the antiproliferative activities against cancer cells were measured by SRB assay;The nude mice were transplanted with cancer cells，then iv by different doses of"Kui long grass"injection，to observe the antitumor effects，the size and weight of the tumor were measured.Results："Kui long grass"injection could inhibit the proliferation of cancer cell lines（A549 cell，MDAMB231 cell，HepG2 cell，HCT116 cell，A431 cell）;It also showed that the nude mice transplanted with S180，H22，HepA，BGC823 cell proliferation was inhibited;Conclusion：It suggests that"Kui long grass"injection has the inhibitory effects on the proliferation of human cancer cell lines in vitro and the tumor growth of nude mice transplanted with S180，H22，HepA，BGC823 cell in vivo，has broad prospects.
Keywords：Kui long grass;tumor cells;cell proliferation;antitumor effects
惡性肿瘤是严重威胁人类生命和健康的重大恶性疾病，且近年来发病率逐年升高。目前肿瘤的主要治疗手段是手术与放化疗，手术疗法尽管能够直接切除肿瘤病灶组织，但是易损伤人体“元气”，降低机体抗病能力且对已经转移的肿瘤无效，因此手术后易复发，往往需要和化疗相结合[1]。长期大量地应用西药与放化疗治疗肿瘤，虽然短期内效果较好，但在杀死肿瘤细胞的同时也会杀死机体正常细胞，还会导致胃肠紊乱，骨髓抑制与免疫抑制等较大的毒副作用，大大降低了患者的生存质量，而继发性耐药是西药化疗过程中的又一突出问题。因此，开发疗效可靠、毒副作用低的抗肿瘤药物制剂具有重大意义。 肿瘤在我国传统医学中被称为“石瘕”“石疽”“岩”等，多为有形之物，坚硬如石。肿瘤病机总体上多为正虚、血瘀、痰瘀、热毒等几方面，中医治疗肿瘤的方法有清热解毒法、扶正培本法、活血化瘀法、软坚散结法以及以毒攻毒法等[12]。中草药是我国人民数千年来与疾病斗争的智慧结晶，具有多成分、多靶点、多功效的综合作用特点，研究表明，中草药在抑制杀伤肿瘤细胞、改善症状与体征、减轻化疗不良反应、提高生存质量、防止复发转移与延长生存期等方面发挥着巨大的作用;另外，由于中草药活性成分复杂多样，因此能够有效避免恶性肿瘤化疗过程中的继发性耐药问题[3]。本文在中医药理论指导下组方制备得“葵龙草”抗肿瘤注射液，并对其体内外抗肿瘤活性进行了研究。
1 仪器与试药
（1）试药：“葵龙草”注射液;环磷酰胺注射液（200mg/支）。
（2）肿瘤细胞株：人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MDAMB231、人肝癌细胞HepG2、人结肠癌细胞HCT116、人皮肤鳞状细胞癌细胞A431，由中国医学科学院提供。
（3）实验动物：S180、H22、HepA、BGC823等肿瘤传代小鼠：昆明种小鼠，雌雄各半，体重20～24g;4～6周龄。
（4）试剂与仪器：SRB细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒;8000WJ5%CO2饱和湿度孵育箱;FCANF129004酶标仪;AB104S/FACT电子天平。
2 “葵龙草”注射液的制备
2.1 药材的提取精制
在中医药理论指导下选药组方，称取处方量的天葵子、龙葵、猫爪草、仙鹤草、红景天，加8倍量水，浸泡30min，煎煮提取3次，每次1h，将提取液减压浓缩至清膏，放至室温，加入乙醇，冷藏静置24h，过滤;滤液减压回收乙醇至无醇味，加入明胶溶液，边加边搅拌直到不产生明显沉淀为止，静置30min后再加入乙醇，冷藏静置24h，过滤除去沉淀，滤液减压回收乙醇至无醇味，加注射用水，加热至微沸保持30min，放至室温，冷藏静置48h，过滤，收集滤液。
2.2 灌封灭菌
将所得滤液加热至60℃，加入0.3%注射级用活性炭，保温搅拌15min，滤除活性炭，加注射用水至所需制剂体积;依次经0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤，再用截留分子量8000～30000的超滤膜，在压力为0.05～0.3MPa下进行超滤，超滤液经灌封、灭菌、包装后即得具有抗肿瘤作用的中药组合物注射液“葵龙草”注射液。
3 “葵龙草”注射液体外抗肿瘤活性研究[4，6]
（1）方法：①将对数生长期的细胞消化后，吹打成单细胞悬液，接种于96孔培养板;（2～5）×103个细胞/孔，每孔培养基200μL，37℃、5%CO2培养箱中培养过夜;②加入梯度剂量的“葵龙草”注射液（经过血浆孵育），在培养箱中继续培养3天;③用10%三氯醋酸固定1小时;④用双蒸水洗涤，干燥后，每孔加入70μLSRB溶液（4mg/mL），室温染色20分钟，1%醋酸洗涤，干燥;⑤每孔加入10mM TrisBase溶液100μL使SRB溶解;⑥酶标仪在515nm检测各孔OD值，记录结果;⑦抑制率计算公式：
细胞增殖抑制率=[OD对照-OD给药]/OD对照×100%
（2）结果：本实验选取了人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MDAMB231、人肝癌细胞HepG2、人结肠癌细胞HCT116、人皮肤鳞状细胞癌细胞A431作为靶向细胞，结果显示“葵龙草”注射液能够显著抑制肿瘤细胞株的增殖，表明“葵龙草”注射液具有较好的抗肿瘤活性，抗瘤谱较广，且其抗肿瘤作用呈剂量依赖性，结果见表1。
4 “葵龙草”注射液对肿瘤小鼠的作用[46]
（1）方法：①昆明种小鼠随机分为对照组（ig生理盐水，2.5mL/Kg）、环磷酰胺组（ip20mL/Kg）、“葵龙草”注射液组（ig2.5mL/Kg）;②在无菌条件下，将传代7天的供体动物，S180、H22、HepA、BGC823肿瘤传代小鼠的腹部用碘酒和酒精消毒后，用无菌注射器抽取包含有大量癌细胞的腹水，用生理盐水稀释成细胞悬液后并计数调整细胞数为107个/mL;③将已调好细胞悬液0.2mL接种于各组小鼠右腋皮下，操作在30min内完成。④各组动物，于接种后次日开始分别给药，每天1次，连续给药10天;⑤末次给药24h后，处死动物，小心剥离肿瘤组织称重并计算平均瘤重（W），按照下述公式计算肿瘤生长抑制率：
肿瘤生长抑制率=[W对照-W治疗]/W对照×100%
（2）结果：体内实验研究表明本发明注射液具有一定的抗肿瘤生长作用，能显著抑制裸鼠移植S180、H22、HepA、BGC823细胞的增殖，结果见表2。
5 结语
开发安全有效、不良反应小的抗肿瘤药物一直是肿瘤药物研发的主要目标，从天然产物及中药中发现具有活性的抗肿瘤药物是目前的研究热点。本文中“葵龙草”抗肿瘤注射液在中医药理论指导下，以“攻毒散结、收敛止血、益气安神”为治则，并根据恶性肿瘤的中、晚期患者体质特点选药组方，采用现代药剂学制剂技术研制而成。此注射液保持了天然中草药多成分、多靶点、多功效的综合作用特点，通过多种作用机制对多种肿瘤细胞具有显著的抑杀作用，不易产生耐药性，是一种具有广阔应用前景的中草药抗肿瘤制剂。但其毒性范围及抗肿瘤活性剂量之间的关系仍有待深入研究。
参考文献：
[1]张忠太，刘凌燕.应用中医药理论剖析中草药对肿瘤治疗的现状[J].肿瘤研究与临床，2006，18（1）：5859.
[2]王朋，张慧玲.活血化瘀法在肿瘤治疗中的应用[J].现代中西医结合杂志，2012，21（24）：27352736.
[3]李亚光，蔡捷，苏承武.中医药在肿瘤治疗中增效减毒作用的研究进展[J].蛇志，2009，21（3）：209211.
[4]任美萍，刘明华，李蓉，等.黄芪多糖抗肿瘤活性研究[J].中国新药杂志，2010，19（3）：221224.
[5]李宜明，沈业寿，王清，等.抗肿瘤药物的筛选方法[J].安徽大学学报（自然科学版），2005，29（1）：9096.
[6]程卉，彭代银，王效山，等.新藤黄酸体内外抗肿瘤作用研究[J].中草药，2008，39（2）：2362.
基金：陜西省教育厅自然科学基金19JK0759;西安医学院2019大学生创新训练项目121519018
*通讯作者：赵宁（1984— ），女，硕士，副教授。
关键词：“葵龙草”注射液;肿瘤细胞;细胞增殖;抗肿瘤作用
中图分类号：R932 文献标识码：A
Antitumor effects of“Kui long grass”both in vivo and in vitro
Luo Jiaojiao Zhu Ting Zhao Ning* Li Weize Wang Xiaoning
College of Pharmaceutical Science Xi’an Medical University ShaanxiXi’an 710021
Abstract：Objective：To investigate the antitumor effects of“Kui long grass"injection both in vivo and in vitro.Methods：The human tumor cell lines as a model，the antiproliferative activities against cancer cells were measured by SRB assay;The nude mice were transplanted with cancer cells，then iv by different doses of"Kui long grass"injection，to observe the antitumor effects，the size and weight of the tumor were measured.Results："Kui long grass"injection could inhibit the proliferation of cancer cell lines（A549 cell，MDAMB231 cell，HepG2 cell，HCT116 cell，A431 cell）;It also showed that the nude mice transplanted with S180，H22，HepA，BGC823 cell proliferation was inhibited;Conclusion：It suggests that"Kui long grass"injection has the inhibitory effects on the proliferation of human cancer cell lines in vitro and the tumor growth of nude mice transplanted with S180，H22，HepA，BGC823 cell in vivo，has broad prospects.
Keywords：Kui long grass;tumor cells;cell proliferation;antitumor effects
惡性肿瘤是严重威胁人类生命和健康的重大恶性疾病，且近年来发病率逐年升高。目前肿瘤的主要治疗手段是手术与放化疗，手术疗法尽管能够直接切除肿瘤病灶组织，但是易损伤人体“元气”，降低机体抗病能力且对已经转移的肿瘤无效，因此手术后易复发，往往需要和化疗相结合[1]。长期大量地应用西药与放化疗治疗肿瘤，虽然短期内效果较好，但在杀死肿瘤细胞的同时也会杀死机体正常细胞，还会导致胃肠紊乱，骨髓抑制与免疫抑制等较大的毒副作用，大大降低了患者的生存质量，而继发性耐药是西药化疗过程中的又一突出问题。因此，开发疗效可靠、毒副作用低的抗肿瘤药物制剂具有重大意义。 肿瘤在我国传统医学中被称为“石瘕”“石疽”“岩”等，多为有形之物，坚硬如石。肿瘤病机总体上多为正虚、血瘀、痰瘀、热毒等几方面，中医治疗肿瘤的方法有清热解毒法、扶正培本法、活血化瘀法、软坚散结法以及以毒攻毒法等[12]。中草药是我国人民数千年来与疾病斗争的智慧结晶，具有多成分、多靶点、多功效的综合作用特点，研究表明，中草药在抑制杀伤肿瘤细胞、改善症状与体征、减轻化疗不良反应、提高生存质量、防止复发转移与延长生存期等方面发挥着巨大的作用;另外，由于中草药活性成分复杂多样，因此能够有效避免恶性肿瘤化疗过程中的继发性耐药问题[3]。本文在中医药理论指导下组方制备得“葵龙草”抗肿瘤注射液，并对其体内外抗肿瘤活性进行了研究。
1 仪器与试药
（1）试药：“葵龙草”注射液;环磷酰胺注射液（200mg/支）。
（2）肿瘤细胞株：人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MDAMB231、人肝癌细胞HepG2、人结肠癌细胞HCT116、人皮肤鳞状细胞癌细胞A431，由中国医学科学院提供。
（3）实验动物：S180、H22、HepA、BGC823等肿瘤传代小鼠：昆明种小鼠，雌雄各半，体重20～24g;4～6周龄。
（4）试剂与仪器：SRB细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒;8000WJ5%CO2饱和湿度孵育箱;FCANF129004酶标仪;AB104S/FACT电子天平。
2 “葵龙草”注射液的制备
2.1 药材的提取精制
在中医药理论指导下选药组方，称取处方量的天葵子、龙葵、猫爪草、仙鹤草、红景天，加8倍量水，浸泡30min，煎煮提取3次，每次1h，将提取液减压浓缩至清膏，放至室温，加入乙醇，冷藏静置24h，过滤;滤液减压回收乙醇至无醇味，加入明胶溶液，边加边搅拌直到不产生明显沉淀为止，静置30min后再加入乙醇，冷藏静置24h，过滤除去沉淀，滤液减压回收乙醇至无醇味，加注射用水，加热至微沸保持30min，放至室温，冷藏静置48h，过滤，收集滤液。
2.2 灌封灭菌
将所得滤液加热至60℃，加入0.3%注射级用活性炭，保温搅拌15min，滤除活性炭，加注射用水至所需制剂体积;依次经0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤，再用截留分子量8000～30000的超滤膜，在压力为0.05～0.3MPa下进行超滤，超滤液经灌封、灭菌、包装后即得具有抗肿瘤作用的中药组合物注射液“葵龙草”注射液。
3 “葵龙草”注射液体外抗肿瘤活性研究[4，6]
（1）方法：①将对数生长期的细胞消化后，吹打成单细胞悬液，接种于96孔培养板;（2～5）×103个细胞/孔，每孔培养基200μL，37℃、5%CO2培养箱中培养过夜;②加入梯度剂量的“葵龙草”注射液（经过血浆孵育），在培养箱中继续培养3天;③用10%三氯醋酸固定1小时;④用双蒸水洗涤，干燥后，每孔加入70μLSRB溶液（4mg/mL），室温染色20分钟，1%醋酸洗涤，干燥;⑤每孔加入10mM TrisBase溶液100μL使SRB溶解;⑥酶标仪在515nm检测各孔OD值，记录结果;⑦抑制率计算公式：
细胞增殖抑制率=[OD对照-OD给药]/OD对照×100%
（2）结果：本实验选取了人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MDAMB231、人肝癌细胞HepG2、人结肠癌细胞HCT116、人皮肤鳞状细胞癌细胞A431作为靶向细胞，结果显示“葵龙草”注射液能够显著抑制肿瘤细胞株的增殖，表明“葵龙草”注射液具有较好的抗肿瘤活性，抗瘤谱较广，且其抗肿瘤作用呈剂量依赖性，结果见表1。
4 “葵龙草”注射液对肿瘤小鼠的作用[46]
（1）方法：①昆明种小鼠随机分为对照组（ig生理盐水，2.5mL/Kg）、环磷酰胺组（ip20mL/Kg）、“葵龙草”注射液组（ig2.5mL/Kg）;②在无菌条件下，将传代7天的供体动物，S180、H22、HepA、BGC823肿瘤传代小鼠的腹部用碘酒和酒精消毒后，用无菌注射器抽取包含有大量癌细胞的腹水，用生理盐水稀释成细胞悬液后并计数调整细胞数为107个/mL;③将已调好细胞悬液0.2mL接种于各组小鼠右腋皮下，操作在30min内完成。④各组动物，于接种后次日开始分别给药，每天1次，连续给药10天;⑤末次给药24h后，处死动物，小心剥离肿瘤组织称重并计算平均瘤重（W），按照下述公式计算肿瘤生长抑制率：
肿瘤生长抑制率=[W对照-W治疗]/W对照×100%
（2）结果：体内实验研究表明本发明注射液具有一定的抗肿瘤生长作用，能显著抑制裸鼠移植S180、H22、HepA、BGC823细胞的增殖，结果见表2。
5 结语
开发安全有效、不良反应小的抗肿瘤药物一直是肿瘤药物研发的主要目标，从天然产物及中药中发现具有活性的抗肿瘤药物是目前的研究热点。本文中“葵龙草”抗肿瘤注射液在中医药理论指导下，以“攻毒散结、收敛止血、益气安神”为治则，并根据恶性肿瘤的中、晚期患者体质特点选药组方，采用现代药剂学制剂技术研制而成。此注射液保持了天然中草药多成分、多靶点、多功效的综合作用特点，通过多种作用机制对多种肿瘤细胞具有显著的抑杀作用，不易产生耐药性，是一种具有广阔应用前景的中草药抗肿瘤制剂。但其毒性范围及抗肿瘤活性剂量之间的关系仍有待深入研究。
参考文献：
[1]张忠太，刘凌燕.应用中医药理论剖析中草药对肿瘤治疗的现状[J].肿瘤研究与临床，2006，18（1）：5859.
[2]王朋，张慧玲.活血化瘀法在肿瘤治疗中的应用[J].现代中西医结合杂志，2012，21（24）：27352736.
[3]李亚光，蔡捷，苏承武.中医药在肿瘤治疗中增效减毒作用的研究进展[J].蛇志，2009，21（3）：209211.
[4]任美萍，刘明华，李蓉，等.黄芪多糖抗肿瘤活性研究[J].中国新药杂志，2010，19（3）：221224.
[5]李宜明，沈业寿，王清，等.抗肿瘤药物的筛选方法[J].安徽大学学报（自然科学版），2005，29（1）：9096.
[6]程卉，彭代银，王效山，等.新藤黄酸体内外抗肿瘤作用研究[J].中草药，2008，39（2）：2362.
基金：陜西省教育厅自然科学基金19JK0759;西安医学院2019大学生创新训练项目121519018
*通讯作者：赵宁（1984— ），女，硕士，副教授。