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摘要：采集室内观赏植物巴西木叶片，经过富集培养、血平板筛选、发酵液排油能力测定和发酵液表面张力测定等，筛选出具有产生物表面活性剂能力的菌株J3-21。对其培养条件进行，确定氯化铵和蔗糖为氮源和碳源时，在28℃条件下，再补充部分酵母粉，可以使发酵液表面张力可降低至25 mN/m。
关键词：生物表面活性剂；表面张力；培养条件优化
生物表面活性剂（biosurfactant）是由微生物产生的具有高表面活性的生物分子，是集亲水基和疏水基结构于一身的两亲化合物[1，2]。相对于化学合成的表面活性剂，生物表面活性剂对生态系统的毒性较低，且可生物降解。因此，生物表面活性剂的特性决定了其在医药、石油工业、化妆品、洗涤剂、环境工程和食品工业等领域的广泛应用[2]。植物叶片表面因为存在蜡质等植物保护性物质，是筛选产生表面活性物质的微生物的重要环境之一。
1.材料与方法
1.1植物样品
室内景观植物巴西木叶片。
1.2仪器与试剂
LDZX-40BI型立式电热压力蒸汽灭菌器、ZD-85恒温振荡器、FA1104电子天平、SW-CJ2FD洁净工作台、LRH-280生化培养箱、JK99C全自动表面张力仪。试剂均为分析纯。
1.3方法
1）菌株富集与分离。称取样品10g，加入90ml无菌水，150r/min摇床振荡1h，取上清液10ml接种到100ml已灭菌的富集培养集中，于37℃、150r/min的恒温摇床上振荡培养3d。在同样条件下进行二次培养。取二次富集培养的培养液1mL，用无菌水进行梯度稀释（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7浓度）。巴西木叶片，置于富集培养基中，经过15天富集后，将富集液体涂布于血平板培养基上，挑去能够产生溶血圈的菌株，作为备选菌株。
2）菌株的筛选。将纯菌株接种到50ml发酵培养基中，于28℃、150 r/min条件下培养72h。取100μl发酵液接种到已灭菌的100ml发酵培养基中，于37℃、150r/min培养3d。取直径20cm培养皿，经过二次酸洗后加二次蒸馏水30ml，滴加8ml液体石蜡，等待20-30min，形成稳定油膜后加入100μl发酵液于油膜中心，测定排油圈直径。
3）发酵培养。将纯菌株接种到50ml发酵培养基中，于28℃、150r/min条件下培养72h。
4）单因素培养条件优化。以发酵培养基为基础，对碳源、氮源的种类及培养温度进行单因素试验，确定C源、N源的种类及培养温度。
5）正交实验设计。以碳源、氮源、酵母粉和培养时间为影响因素，以各因素添加量和时间为不同水平，以表面张力下降情况和菌浓作为考察指标，设计四因素三水平正交试验，如下表1：
6）菌种鉴定 对筛选所得的菌株进行革兰氏染色、芽孢染色及生理生化试验鉴定，确定细菌的种属。
2.结果与讨论
2.1产表面活性剂菌株的分离筛选结果
对巴西木叶片中的微生物种群中表面活性物质产生菌株进行富集培养，再经过血平板分离，共获得21株备选细菌菌株，对各菌株进一步考察，测定发酵液的排油能力，得到备选产表面活性剂的菌株4株，测量到这些菌株的排油圈直径，大于4cm，说明这些菌株的代谢产物有较好的排油性能，而效果最好的一株菌编号为J3-21，排油圈直径达6.5cm。
2.2菌株培养基条件的优化
1）碳源的选择。分别以葡萄糖、蔗糖、乳糖、柠檬酸钠、草酸、可溶性淀粉为碳源，在28℃，初始pH值为7.0～7.2，150r/min条件下恒温振荡培养72h，分别测定发酵液的排油能力。
由图1a可知，蔗糖为碳源时菌株J3-21发酵液的排油活性最好，表面张力降低至27.2mN/m（注：20摄氏度条件下，空白培养基的表面张力为65.7mN/m），因此，选择蔗糖为最佳碳源。
2）氮源的选择。分别以硝酸钠、氯化铵、硝酸钾、蛋白胨、牛肉膏这 5种氮源，以蔗糖为碳源，初始pH值为7.0～7.2，28℃、150r/min条件下恒温振荡培养3d后，测定发酵液的排油活性。
由图1b可知，氯化铵为碳源时菌株J3-21发酵液的表面张力降低至25.2mN/m（注：20摄氏度条件下，空白培养基的表面张力为65.7mN/m），因此，选择氯化铵为最佳氮源。
3）培养温度的选择。以蔗糖为碳源，氯化铵为氮源，初始pH值为 7.0～7.2，分别于24、28、32、36℃，150r/min条件下恒温振荡培养3天，测定发酵液的排油活性。当培养温度为28℃时，
由图1c可知，培养温度为28℃时菌株J3-21发酵液的表面张力降低至25.2mN/m（注：20摄氏度条件下，空白培养基的表面张力为65.7 mN/m），因此，选择28℃为较优良的培养温度。
2.3 菌種鉴定
对菌株J3-21进行了革兰氏染色、芽孢染色。在油镜下观察，该菌株呈细长杆状；革兰氏染色后，菌体为紫色；经孔雀绿-番红染色后，可观察到红色的菌体和绿色的芽孢区，芽孢较小。J3-21的生理生化反应结果见表2：
3.结论
综合以上结果，培养基中，氮源和酵母粉添加量会对J3-21发酵液中菌浓和表面活性物质产生较大影响，生物表面活性物质产量与菌浓存在一定的负相关，可能表活物质对菌株具有一定的抑制作用，次级代谢产物的积累不利于菌体的生长。因此，后期实验中准备通过培养中进行补料的形式，在较高菌浓情况下对培养基进行补料以产生更多的表面活性物质。
参考文献：
[1]张卉，郝国良，徐俊斌.生物表面活性剂产生菌的筛选及培养条件优化[J].沈阳师范大学学报（自然科学版），2012，04：477-485
[2]卢国满.产表面活性剂菌株的筛选、发酵条件优化及定量研究[D].湖南大学，环境科学专业，2006年
关键词：生物表面活性剂；表面张力；培养条件优化
生物表面活性剂（biosurfactant）是由微生物产生的具有高表面活性的生物分子，是集亲水基和疏水基结构于一身的两亲化合物[1，2]。相对于化学合成的表面活性剂，生物表面活性剂对生态系统的毒性较低，且可生物降解。因此，生物表面活性剂的特性决定了其在医药、石油工业、化妆品、洗涤剂、环境工程和食品工业等领域的广泛应用[2]。植物叶片表面因为存在蜡质等植物保护性物质，是筛选产生表面活性物质的微生物的重要环境之一。
1.材料与方法
1.1植物样品
室内景观植物巴西木叶片。
1.2仪器与试剂
LDZX-40BI型立式电热压力蒸汽灭菌器、ZD-85恒温振荡器、FA1104电子天平、SW-CJ2FD洁净工作台、LRH-280生化培养箱、JK99C全自动表面张力仪。试剂均为分析纯。
1.3方法
1）菌株富集与分离。称取样品10g，加入90ml无菌水，150r/min摇床振荡1h，取上清液10ml接种到100ml已灭菌的富集培养集中，于37℃、150r/min的恒温摇床上振荡培养3d。在同样条件下进行二次培养。取二次富集培养的培养液1mL，用无菌水进行梯度稀释（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7浓度）。巴西木叶片，置于富集培养基中，经过15天富集后，将富集液体涂布于血平板培养基上，挑去能够产生溶血圈的菌株，作为备选菌株。
2）菌株的筛选。将纯菌株接种到50ml发酵培养基中，于28℃、150 r/min条件下培养72h。取100μl发酵液接种到已灭菌的100ml发酵培养基中，于37℃、150r/min培养3d。取直径20cm培养皿，经过二次酸洗后加二次蒸馏水30ml，滴加8ml液体石蜡，等待20-30min，形成稳定油膜后加入100μl发酵液于油膜中心，测定排油圈直径。
3）发酵培养。将纯菌株接种到50ml发酵培养基中，于28℃、150r/min条件下培养72h。
4）单因素培养条件优化。以发酵培养基为基础，对碳源、氮源的种类及培养温度进行单因素试验，确定C源、N源的种类及培养温度。
5）正交实验设计。以碳源、氮源、酵母粉和培养时间为影响因素，以各因素添加量和时间为不同水平，以表面张力下降情况和菌浓作为考察指标，设计四因素三水平正交试验，如下表1：
6）菌种鉴定 对筛选所得的菌株进行革兰氏染色、芽孢染色及生理生化试验鉴定，确定细菌的种属。
2.结果与讨论
2.1产表面活性剂菌株的分离筛选结果
对巴西木叶片中的微生物种群中表面活性物质产生菌株进行富集培养，再经过血平板分离，共获得21株备选细菌菌株，对各菌株进一步考察，测定发酵液的排油能力，得到备选产表面活性剂的菌株4株，测量到这些菌株的排油圈直径，大于4cm，说明这些菌株的代谢产物有较好的排油性能，而效果最好的一株菌编号为J3-21，排油圈直径达6.5cm。
2.2菌株培养基条件的优化
1）碳源的选择。分别以葡萄糖、蔗糖、乳糖、柠檬酸钠、草酸、可溶性淀粉为碳源，在28℃，初始pH值为7.0～7.2，150r/min条件下恒温振荡培养72h，分别测定发酵液的排油能力。
由图1a可知，蔗糖为碳源时菌株J3-21发酵液的排油活性最好，表面张力降低至27.2mN/m（注：20摄氏度条件下，空白培养基的表面张力为65.7mN/m），因此，选择蔗糖为最佳碳源。
2）氮源的选择。分别以硝酸钠、氯化铵、硝酸钾、蛋白胨、牛肉膏这 5种氮源，以蔗糖为碳源，初始pH值为7.0～7.2，28℃、150r/min条件下恒温振荡培养3d后，测定发酵液的排油活性。
由图1b可知，氯化铵为碳源时菌株J3-21发酵液的表面张力降低至25.2mN/m（注：20摄氏度条件下，空白培养基的表面张力为65.7mN/m），因此，选择氯化铵为最佳氮源。
3）培养温度的选择。以蔗糖为碳源，氯化铵为氮源，初始pH值为 7.0～7.2，分别于24、28、32、36℃，150r/min条件下恒温振荡培养3天，测定发酵液的排油活性。当培养温度为28℃时，
由图1c可知，培养温度为28℃时菌株J3-21发酵液的表面张力降低至25.2mN/m（注：20摄氏度条件下，空白培养基的表面张力为65.7 mN/m），因此，选择28℃为较优良的培养温度。
2.3 菌種鉴定
对菌株J3-21进行了革兰氏染色、芽孢染色。在油镜下观察，该菌株呈细长杆状；革兰氏染色后，菌体为紫色；经孔雀绿-番红染色后，可观察到红色的菌体和绿色的芽孢区，芽孢较小。J3-21的生理生化反应结果见表2：
3.结论
综合以上结果，培养基中，氮源和酵母粉添加量会对J3-21发酵液中菌浓和表面活性物质产生较大影响，生物表面活性物质产量与菌浓存在一定的负相关，可能表活物质对菌株具有一定的抑制作用，次级代谢产物的积累不利于菌体的生长。因此，后期实验中准备通过培养中进行补料的形式，在较高菌浓情况下对培养基进行补料以产生更多的表面活性物质。
参考文献：
[1]张卉，郝国良，徐俊斌.生物表面活性剂产生菌的筛选及培养条件优化[J].沈阳师范大学学报（自然科学版），2012，04：477-485
[2]卢国满.产表面活性剂菌株的筛选、发酵条件优化及定量研究[D].湖南大学，环境科学专业，2006年