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中圖分类号 R285;R361+.3 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2021）20-2450-09
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.20.04
摘 要 目的：初步研究消癥汤对大鼠子宫平滑肌瘤细胞增殖和迁移的影响及作用机制。方法：将雌性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、化学药阳性对照组（米非司酮片2.25 mg/kg）、中药阳性对照组（桂枝茯苓胶囊200 mg/kg）和消癥汤低、中、高剂量组（1.4、2.8、5.6 g/kg），每组15只。除正常对照组外，其余各组大鼠均肌内注射雌激素和孕激素建立子宫平滑肌瘤模型。自建模第2天起，各给药组大鼠灌胃相应药液，正常对照组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水，每天1次，连续4个月。末次给药后，摘取子宫并观察其形态，计算子宫系数;分离培养子宫平滑肌瘤细胞或子宫平滑肌细胞，采用MTT法检测细胞增殖率，细胞划痕实验检测子宫平滑肌瘤细胞迁移率，流式细胞术检测细胞凋亡率，荧光定量聚合酶链反应技术检测细胞中高迁移率族蛋白B1（HMGB1）mRNA表达情况，酶联免疫吸附测定法检测细胞中磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、核因子κB抑制蛋白α（IκBα）、磷酸化转化生长因子β激活激酶1（p-TAK1）的表达水平，Western blot法检测细胞质内HMGB1、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、p-Akt蛋白和细胞核内核因子κB p65（NF-κB p65）蛋白的表达水平。结果：与正常对照组比较，模型组大鼠子宫肌层明显增厚，子宫平滑肌细胞明显增多且大小不一，部分区域的肌纤维排列紊乱，子宫系数和细胞中HMGB1 mRNA及其蛋白的相对表达水平均显著升高（P<0.01）。与模型组比较，消癥汤各剂量组以及各阳性对照组大鼠的子宫平滑肌层增厚等情况均有不同程度改善，子宫系数以及子宫平滑肌瘤细胞增殖率、相对迁移率和细胞中HMGB1 mRNA及其蛋白的相对表达水平，p-Akt、IκBα的表达水平，细胞质中PI3K、p-Akt蛋白的相对表达水平（除消癥汤低剂量组外）均显著降低（P<0.05或P<0.01），子宫平滑肌瘤细胞凋亡率和细胞中p-TAK1的表达水平、细胞核内NF-κB p65蛋白的相对表达水平均显著升高（P<0.05或P<0.01），且消癥汤的作用有剂量依赖的趋势。结论：消癥汤可能通过下调HMGB1、PI3K、p-Akt表达，上调NF-κB p65表达，进而抑制子宫平滑肌瘤细胞的增殖和迁移，并促使其凋亡。
关键词 消癥汤;子宫平滑肌瘤;高迁移率族蛋白B1;磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B;核因子κB;大鼠
Effects and Mechanism of Xiaozheng Decoction on the Proliferation and Migration of Uterine Leiomyoma Cells in Rat
WU Yanli，FAN Kai，KONG Shoufang，ZHAO Xiufang，OUYANG Jianghua（Dept. of Gynaecology， Qingdao Hospital of TCM， Shandong Qingdao 266033， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects and mechanism of Xiaozheng decoction on the proliferation and migration of uterine leiomyoma cells in rat. METHODS： Female SD rats were randomly divided into normal control group， model group， chemical medicine positive control group （Mifepristone tablets， 2.25 mg/kg）， TCM positive control group （Guizhi fuling capsules， 200 mg/kg）， Xiaozheng decoction low-dose， medium-dose and high-dose groups （1.4， 2.8， 5.6 g/kg）， with 15 rats in each group. Except for normal control group， other groups were given intramuscular injection of estrogen and progesterone to induce uterine leiomyomas model. On the second day after modeling， rats in administration groups were given relevant medicine intragastrically; normal control group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 4 months. After last administration， the uterus was removed and its morphology was observed; the uterine coefficient was calculated. Uterine leiomyoma cells or uterine smooth muscle cells were isolated and cultured. The proliferation rate and migration rate of cells were detected by MTT method and cell scratch test; flow cytometry was used to detect the cell apoptosis rate; mRNA expression of HMGB1 were detected by RT-qPCR. The expression of phosphorylated protein kinase B （p-Akt）， nuclear factor κB inhibitor α （IκBα） and phosphorylated transforming growth factor β-activated kinase 1 （p-TAK1） were detected by ELISA; the protein expression of HMGB1， phospholipid 3 kinase （PI3K）， p-Akt in cytoplasm and nuclear factor κB p65（NF-κB p65） in nucleus were detected by Western blot assay. RESULTS： Compared with normal control group， the myometrium of the model group was significantly thickened， the number of uterine smooth muscle cells were significantly increased and the sizes were different， the arrangement of muscle fibers in some areas was disordered， the uterine coefficient， and the relative expression of HMGB1 mRNA and protein were increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， the thickening of uterine myometrium and other symptoms were improved to different extents in Xiaozheng decoction groups and positive control groups; the uterine coefficient， cell proliferation rate， migration rate， mRNA and protein expression of HMGB1， the expression of p-Akt and IκBα， protein expression of PI3K and p-Akt （except for Xiaozheng decoction low-dose group） in cytoplasm were all decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; the cell apoptosis rate， the expression of p-TAK1， protein expression of NF-κB p65 in nucleus were all increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The effects of Xiaozheng decoction showed a dose-dependent trend. CONCLUSIONS： Xiaozheng decoction can inhibit the proliferation and migration of uterine leiomyoma cells by down-regulating the expression of HMGB1， PI3K and p-Akt， up-regulating the expression of NF-κB p65， so as to promote cell apoptosis. KEYWORDS Xiaozheng decoction; Uterine leiomyoma; HMGB1; PI3K/Akt; NF-κB; Rat
子宫平滑肌瘤是一种由雌激素水平过高引起的平滑肌细胞良性增生，临床表现为下腹部疼痛、月经周期缩短、白带增多、经量增多和经期延长等。子宫平滑肌瘤虽然是一种良性肿瘤，但是如果不及时治疗，还是会对患者身体造成极大的损伤，甚至可能导致不孕[1]。目前，除了手术治疗[2]外，还有多种中药[3-4]和化学药[5-6]在实验室和临床上被证实可以有效缓解和治疗子宫平滑肌瘤。与化学药治疗相比，传统的中药因具有副作用少、来源广泛等优点，被临床广泛关注和使用。
高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是一种高度保守的核蛋白，在哺乳动物细胞中普遍表达。有研究指出，HMGB1可通过激活促炎性细胞因子[肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）等]来参与脓毒症、类风湿性关节炎、结肠炎和急性肺损伤等多种疾病的晚期炎症反应[7-10]。此外，HMGB1在子宫平滑肌瘤和子宫内膜癌组织中呈高表达[11]，并且可能对子宫平滑肌瘤细胞的增殖具有一定的促进作用[12]。有研究表明，干扰HMGB1蛋白的表达可以抑制膀胱癌细胞和血管瘤内皮细胞的增殖，并诱导其凋亡[13-14]。
细胞内应激与凋亡反应可以程序性地诱导细胞凋亡或自噬，进而引起多种组织损伤[15]。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路是细胞内重要的信号转导通路之一，可调控包括HMGB1在内的多种蛋白的表达，同时也参与调节细胞内应激与凋亡反应[16-18]。核因子κB（NF-κB）可通过调控细胞核内基因的转录，参与细胞对应激等刺激的反应[19]。有研究表明，通过直接控制或间接调控PI3K/Akt和NF-κB信号通路的激活，可以有效缓解细胞应激产生的负面影响，如炎症等[19-20]。
消癥汤由半枝莲、白花蛇舌草、三棱、莪术、乳香、没药、橘核、皂角刺、海藻、牡蛎、石见穿和荔枝核等药材组成，具有清热利湿、活血止癥的功效[21]。在该汤剂中，半枝莲、石见穿和白花蛇舌草是中医常用的抗癌药物，三棱、莪术、乳香、没药可理气行血、活血化瘀，橘核、荔枝核可祛寒止痛、散结消肿，皂角刺可消肿排脓、疏通经络，海藻可化痰消肿、软坚散结，牡蛎可镇惊安神、滋阴补虚[21]。前期临床研究发现，消癥汤可有效缩小患者子宫平滑肌瘤大小，可减轻其焦虑以及改善其贫血，且复发率明显低于化学药米非司酮[21]。但消癥汤抑制子宫平滑肌瘤细胞的机制尚未明确。为此，本研究拟基于HMGB1表达以及PI3K/Akt、NF-κB信号通路初步探讨消癥汤抑制子宫平滑肌瘤细胞增殖和迁移的作用机制，以期为该方在子宫平滑肌瘤临床治疗中的应用提供参考。
1 材料
1.1 主要仪器
本研究所用主要仪器包括Form Steri-Cycle型CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司），Axio Vert.A1型倒置光学显微镜（德国Zeiss公司），DYCP-31DN型电泳仪、DYCZ-40D型转膜仪（北京六一生物科技有限公司），Amersham ImageQuant 800型多功能成像仪（美国GE公司），HHM-SY96S型多功能酶标仪（深圳恒美生物技术有限公司），Guava easyCyte HT型流式细胞仪（美国Millipore公司），LightCycler480型荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析仪（瑞士Roche公司）等。
1.2 主要药品与试剂
米非司酮片（批号43050609，规格25 mg）购自华润紫竹药业有限公司;桂枝茯苓胶囊（批号120805，规格0.31 g）购自江苏康缘药业股份有限公司;MTT、Ⅰ型胶原酶、0.25%胰酶、胎牛血清（批号分别为M6494、17100017、25200072、10099141）均购自美国Gibco公司;青霉素-链霉素双抗溶液、DMEM/F12培养基（批号分别为J130061、SH30023.01B）均购自美国Hyclone公司;台盼蓝溶液（批号R03130101）购自友康恒业生物科技（北京）有限公司;D-Hanks试液（批号20150504）购自北京索莱宝科技有限公司;膜联蛋白Ⅴ-别藻蓝蛋白（Annexin Ⅴ- APC）细胞凋亡检测试剂盒（含结合缓冲液，批号20151218）购自江苏凯基生物技术股份有限公司;二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒、ECL发光液（批号分别为23225、32209）均购自美国Thermo Fisher Scientific公司;脱脂奶粉（批号P0216）购自上海碧云天生物技术有限公司;兔源HMGB1多克隆抗体、小鼠源β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体、小鼠源PI3K单克隆抗体、兔源磷酸化Akt（p-Akt）多克隆抗体、兔源NF-κB p65多克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔源核纤层蛋白B1（lamin B1）单克隆抗体、HRP标记的免疫球蛋白G二抗（批号分别为ab18256、ab8226、ab140307、ab183894、ab16502、ab194109、ab6721）均購自英国Abcam公司;RNA提取试剂SuperfecTRI total RNA isolation reagent（批号3101-400）购自上海普飞生物技术有限公司;M-MLV反转录试剂盒（批号28025013）购自美国Promega公司;ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（批号7E303A9）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;HMGB1和β-actin引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司设计、合成;PathScan? Antibody Array试剂盒（批号12856S）购自美国Cell Signaling Technology公司;其余试剂均为实验室常用规格或分析纯，水为超纯水。 半枝莲、白花蛇舌草、三棱、莪术、乳香、没药、橘核、皂角刺、海藻、牡蛎、石见穿和荔枝核饮片均由青岛市中医医院提供，经青岛市中医医院主任药师丁月方鉴定均为真品。
1.3 实验动物
本研究所用动物为SPF级SD大鼠，共105只，3月龄，雌性，体质量为（285.0±16.5）g，由青岛医科大学附属医院实验动物中心提供，动物使用许可证号为SYXK（鲁）2019-0022。本实验方案通过动物伦理委员会批准和审核，并严格按照青岛医科大学附属医院关于实验动物使用和保护的相关规定进行操作。
2 方法
2.1 消癥汤的配制
按消癥汤处方比例称取半枝莲15 g、白花蛇舌草15 g、三棱10 g、莪术10 g、（制）乳香4 g、（制）没药4 g、橘核10 g、皂角刺15 g、海藻30 g、牡蛎（先煎）30 g、石见穿15 g和荔枝核10 g，加水300 mL煎煮，煮沸后再文火煎煮10 min，收集药液;药渣再加水200 mL，煮沸后再文火煎煮30 min，收集药液，合并后滤过，将滤液浓缩至112 mL（以生药总量计质量浓度为1.5 g/mL），即得。
2.2 分组、造模与给药
将105只大鼠隨机分为正常对照组、模型组、化学药阳性对照组（米非司酮片2.25 mg/kg[22]）、中药阳性对照组（桂枝茯苓胶囊200 mg/kg[23]）和消癥汤低、中、高剂量组（1.4、2.8、5.6 g/kg，分别按临床成人用药量的0.5、1、2倍换算而得），每组15只。采用肌内注射雌激素和孕激素的方法建立大鼠子宫平滑肌瘤模型[24]：除正常对照组大鼠肌内注射等体积生理盐水外，其余各组大鼠同时肌内注射己烯雌酚（用大豆油稀释至0.4 mg/mL）0.1 mL+黄体酮（用大豆油稀释至10 mg/mL）0.1 mL，每周1次，连续15周。自建模第2天起，各给药组大鼠灌胃相应药液（用生理盐水稀释），正常对照组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水，每天1次，连续4个月。
2.3 大鼠子宫形态的观察与子宫系数的检测
末次给药后，称定各组大鼠体质量后断头处死，摘取子宫，称定子宫质量后，分别以肉眼和显微镜观察子宫形态，并计算子宫系数：子宫系数（mg/g）=子宫质量/体质量。
2.4 大鼠子宫平滑肌细胞/子宫平滑肌瘤细胞的培养
参照文献[25-26]方法制备、培养大鼠子宫平滑肌细胞/子宫平滑肌瘤细胞：在无菌条件下，取正常对照组大鼠的子宫平滑肌组织或模型组、各给药组大鼠的子宫平滑肌瘤组织，利用无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2，下同）冲洗表面3次，取1～2 cm3的组织置于无菌培养皿中，剪碎成1 mm3的小块，加入混合消化液（含0.25%Ⅰ型胶原酶和0.25%胰酶）3 mL，在37 ℃下消化1 h，再加入含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基2 mL终止消化，过200目细胞筛，弃去组织块，以1 000 r/min离心10 min，取上清液置于35 mm培养皿中，在37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。收集第1代和第2代细胞，用台盼蓝染色，检测细胞存活情况。
2.5 大鼠子宫平滑肌瘤细胞增殖率的检测
采用MTT法进行检测。将从各组大鼠体内分离到的且处于对数生长期的子宫平滑肌细胞或子宫平滑肌瘤细胞以1×105个/孔接种于96孔板中，每组设6个复孔，其中3个孔直接加入MTT溶液10 μL ，另外3个孔置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养48 h，于实验终止前加入MTT溶液10 μL 。加入MTT溶液后，各孔均继续培养4 h，再加入二甲基亚砜150 μL终止反应，振荡10 min，利用酶标仪于490 nm波长处测定各孔的吸光度值（A）并计算细胞增殖率：细胞增殖率=（实验组48 h时的A值-实验组0 h时的A值）/（正常对照组48 h时的A值-正常对照组0 h时的A值）×100%。
2.6 大鼠子宫平滑肌瘤细胞相对迁移率的检测
采用细胞划痕实验进行检测。将从模型组和各给药组大鼠体内分离到的且处于对数生长期的子宫平滑肌瘤细胞以5×105个/孔接种于6孔板中，每组设6个复孔。将各组细胞置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞贴壁且生长至70%～80%时，用200 ?L移液枪枪头垂直划出“十”字划痕，用PBS轻柔洗去未贴壁的细胞，加入DMEM/F12培养基（不含胎牛血清）适量，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养，利用倒置光学显微镜对细胞板进行拍照，记录0 h和24 h时同一位置的照片，并记录距划痕边缘一定距离的细胞数量。使用Image J v1.8.0软件计算各组细胞的相对迁移率：相对迁移率（%）=（实验组培养0 h时的细胞数量-实验组培养24 h时的细胞数量）/（模型组培养0 h时的细胞数量-模型组培养24 h时的细胞数量）×100%。实验重复3次。
2.7 大鼠子宫平滑肌瘤细胞凋亡率的检测
采用流式细胞术进行检测。将从模型组和各给药组大鼠体内分离到的且处于对数生长期的子宫平滑肌瘤细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM/F12培养基重悬，以5×105个/孔接种于6孔板中，每组设6个复孔。将各组细胞置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞贴壁且生长至70%～80%时，收集细胞至15 mL离心管（≥1×106个/管）中，以1 500 r/min离心5 min，收集细胞沉淀，用1×D-Hanks试液（pH 7.2）重悬和洗涤2次后，将1×106个细胞重悬于1×结合缓冲液中，加入Annexin Ⅴ-APC试剂10 μL，轻轻混合，在室温（25 ℃）避光条件下孵育15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况并计算凋亡率（以早期凋亡细胞计）。实验重复3次。 2.8 大鼠子宫平滑肌细胞/子宫平滑肌瘤细胞中HMGB1 mRNA表达水平的检测
采用RT-qPCR法进行检测[27]。将从各组大鼠体内分离到的且处于对数生长期的子宫平滑肌细胞或子宫平滑肌瘤细胞以1×106个/孔接种于6孔板中，每组设3个复孔。将各组细胞置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h后，收集细胞至1.5 mL无DNA/RNA酶离心管中，提取各组细胞的总RNA，按照反转录试剂盒说明书方法操作，将RNA反转录成cDNA。以上述cDNA为模板，用焦碳酸二乙酯（DEPC）水稀释10倍后进行扩增。扩增体系（20 ?L）包括2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 ?L，上、下游引物（10 ?mol/L）各0.4 ?L，cDNA模板5 ?L，加水至10 ?L。扩增条件如下：95 ℃预变性3 min;95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。HMGB1的上游引物序列为5′-GATGACAAGCAGCCCTAT-3′，下游引物序列为5′-TCCATGCCAATTTACAAC-3′，产物片段大小为481 bp;β-actin的上游引物序列为5′-TCAGGTCATCACTATCGGC- AAT-3′，下游引物序列为5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′，产物片段大小为432 bp。利用2-ΔΔCt法进行分析，将每组所测得的HMGB1 cDNA拷贝数分别与β-actin相比，再将所得值与正常对照组相比，以两者相对拷贝数比值表示HMGB1 mRNA的相对表达水平。实验重复3次。
2.9 大鼠子宫平滑肌瘤细胞中p-Akt、NF-κB抑制蛋白α、磷酸化转化生长因子β激活激酶1表达水平的检测
利用PathScan? Antibody Array试剂盒以酶联免疫吸附测定法进行检测。实验参考文献[28]进行操作：将从模型组和各给药组大鼠体内分离到的且处于对数生长期的子宫平滑肌瘤细胞以1×106个/孔接种于6孔板中，每组设3个复孔。将各组细胞置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h后，收集细胞，加入裂解液提取细胞总蛋白，利用BCA蛋白定量法计算各组样品的总蛋白量;将总蛋白置于玻片上，使用试剂盒内的生物素化细胞应激与凋亡通路相关细胞因子抗体混合物进行孵育，依次加入试剂盒中的Streptavidin-conjugated HRP和LumiGLO?化學发光液显影。利用多功能成像仪成像并用Image J v1.8.0软件进行分析，以灰度值表示p-Akt、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）、磷酸化转化生长因子β激活激酶1（p-TAK1）的表达水平。实验重复3次。
2.10 大鼠子宫平滑肌瘤细胞中HMGB1、PI3K、p-Akt和NF-κB p65蛋白表达水平的检测
采用Western blot法进行检测。将从各组大鼠体内分离到的且处于对数生长期的子宫平滑肌瘤细胞以1×106个/孔接种于6孔板中，每组设3个复孔。将各组细胞置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h后，收集细胞，加入裂解液提取细胞总蛋白，利用BCA蛋白定量法计算各组样品的总蛋白量，并将蛋白煮沸变性;取变性蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，并用含5%脱脂奶粉的PBST溶液室温封闭2 h;加入HMGB1、PI3K、p-Akt、NF-κB p65、β-actin（用于检测细胞质中蛋白表达的内参）和lamin B1（用于检测细胞核中蛋白表达的内参）一抗（稀释比例均为1 ∶ 2 000），4 ℃下孵育过夜;用TBST溶液清洗3次后，加入HRP标记的免疫球蛋白G二抗（稀释比例为1 ∶ 5 000），室温孵育1 h;用TBST溶液清洗3次后，加入ECL发光液显影。利用多功能成像仪成像并用Image J v1.8.0软件分析，计算目标蛋白与内参蛋白的灰度值比值，再与模型组进行比较，用以表示目标蛋白的相对表达水平。实验重复3次。
2.11 统计学方法
采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。检验水准α=0.05。
3 结果
3.1 大鼠子宫形态与子宫系数变化
正常对照组大鼠子宫肌层正常，子宫平滑肌细胞结构完整、分布均匀。与正常对照组比较，模型组大鼠子宫肌层明显增厚，子宫平滑肌细胞明显增多且大小不一，部分区域的肌纤维排列紊乱;消癥汤中、高剂量组和化学药阳性对照组、中药阳性对照组大鼠子宫肌层未见明显增厚，子宫平滑肌细胞分布较均匀;消癥汤低剂量组大鼠子宫肌层有所增厚，但厚度低于模型组，子宫平滑肌细胞数增加，但少于模型组。
与正常对照组比较，模型组大鼠的子宫系数显著升高（P<0.01）。与模型组比较，消癥汤各剂量组和各阳性对照组大鼠的子宫系数均显著降低（P<0.01），且消癥汤的作用有剂量依赖趋势。结果见表1。
3.2 大鼠子宫平滑肌细胞/子宫平滑肌瘤细胞的存活情况
大鼠子宫平滑肌细胞/子宫平滑肌瘤细胞均生长良好，活细胞比例达98%，具体表现为细胞界限清楚，细胞无破裂，平滑肌细胞呈长梭形或长形，平滑肌瘤细胞密集呈梭形或椭圆形，背景中基本无细胞碎片，细胞无污染。结果见图1。
3.3 消癥汤对大鼠子宫平滑肌瘤细胞增殖的影响
与模型组比较，消癥汤各剂量组和各阳性对照组大鼠子宫平滑肌瘤细胞的增殖率均显著降低（P<0.05或P<0.01），且消癥汤的作用有剂量依赖趋势（见图2）。
3.4 消癥汤对大鼠子宫平滑肌瘤细胞相对迁移率的影响
与模型组比较，消癥汤各剂量组和各阳性对照组大鼠子宫平滑肌瘤细胞的相对迁移率均显著降低（P<0.01），且消癥汤的作用有剂量依赖趋势。结果见表2、图3。 3.5 消癥汤对大鼠子宫平滑肌瘤细胞凋亡的影响
与模型组比较，消癥汤各剂量组和各阳性对照组大鼠子宫平滑肌瘤细胞的凋亡率均显著升高（P<0.01），且消癥汤的作用有剂量依赖趋势。结果见图4、图5。
3.6 消癥汤对大鼠子宫平滑肌瘤细胞细胞质中HMGB1 mRNA及其蛋白表达的影响
与正常对照组比较，模型组大鼠子宫平滑肌瘤细胞细胞质中HMGB1 mRNA及其蛋白的相对表达水平均显著升高（P<0.01）。与模型组比较，消癥汤各剂量组和各阳性对照组大鼠子宫平滑肌瘤细胞细胞质中HMGB1 mRNA及其蛋白的相对表达水平均显著降低（P<0.05或P<0.01），且消癥汤的作用有剂量依赖趋势。结果见图6～图8。
3.7 消癥湯对大鼠子宫平滑肌瘤细胞中p-Akt、IκBα、p-TAK1表达水平的影响
与模型组比较，消癥汤各剂量组和各阳性对照组大鼠子宫平滑肌瘤细胞中p-Akt、IκBα表达水平均显著降低（P<0.05），p-TAK1表达水平均显著升高（P<0.05），且消癥汤的作用有剂量依赖趋势。结果见图9。
3.8 消癥汤对大鼠子宫平滑肌瘤细胞中PI3K、p-Akt、NF-κB p65蛋白表达的影响
与模型组比较，消癥汤各剂量组和各阳性对照组大鼠子宫平滑肌瘤细胞质中PI3K（消癥汤低剂量组除外）和p-Akt蛋白的相对表达量均显著降低（P<0.05或P<0.01），细胞核内NF-κB p65蛋白的相对表达量均显著升高（P<0.05或P<0.01），且消癥汤的作用有剂量依赖趋势。结果见图10、图11。
4 讨论
子宫平滑肌瘤是女性常见的肿瘤之一，其发生与雌激素水平以及遗传因素有关。子宫平滑肌瘤主要由子宫平滑肌细胞增生形成，当肌瘤直径小于5 cm且没有生育要求时多采用药物保守治疗。消癥汤由半枝莲、白花蛇舌草、三棱、莪术、乳香、没药、橘核、皂角刺、海藻、牡蛎、石见穿和荔枝核等药材熬制而成，不仅有活血化瘀、抗肿瘤的功效，而且可以滋阴补血，对子宫平滑肌瘤有潜在的治疗价值[21]。
细胞凋亡是一种正常有序的生理现象，是程序性细胞死亡过程，其涉及一系列调控，比如凋亡相关信号通路的激活、抗凋亡因子活性的抑制以及水解酶的活化等[29]。本研究结果显示，与模型组比较，消癥汤各剂量组和各阳性对照组大鼠的子宫系数和子宫平滑肌瘤细胞增殖率均显著降低，细胞凋亡率均显著升高，表明消癥汤对子宫平滑肌瘤细胞有明显的抑制作用。细胞划痕实验结果显示，消癥汤各剂量组和各阳性对照组大鼠子宫平滑肌瘤细胞的相对迁移率均显著低于模型组，进一步证明了消癥汤对子宫平滑肌瘤细胞具有明显的抑制作用。
已有研究显示，HMGB1在子宫平滑肌瘤等多种肿瘤组织中呈高表达，抑制其表达，可激活细胞凋亡途径，促进细胞凋亡，表明HMGB1具有作为肿瘤标志物以及预后检测指标的潜力[12-13，27]。本研究结果显示，消癥汤各剂量组大鼠子宫平滑肌瘤细胞中HMGB1 mRNA及其蛋白的相对表达水平均显著低于模型组，且随着消癥汤剂量的升高，对HMGB1表达的抑制作用有逐渐增强的趋势，说明消癥汤对子宫平滑肌瘤细胞中HMGB1的高表达具有明显的抑制作用，且有一定的剂量依赖趋势。
细胞内促凋亡与应激信号通路的活化是细胞凋亡的途径之一。已有研究发现，HMGB1、NF-κB p65在子宫内膜肿瘤组织中呈高表达，且通过下调HMGB1相关的NF-κB p65或PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路可诱导肿瘤细胞（如肝癌细胞和子宫内膜癌细胞）的凋亡[30-31]。本文利用PathScan? Antibody Array试剂盒分析了细胞中p-Akt、IκBα、p-TAK1的表达情况，结果发现，与模型组比较，消癥汤各剂量组细胞中p-Akt、IκBα表达水平均显著降低，p-TAK1表达水平均显著升高。同时，本文通过Western blot法检测了细胞中PI3K、p-Akt、NF-κB p65蛋白的表达水平，发现与模型组比较，消癥汤各剂量组细胞质中PI3K（消癥汤低剂量组除外）、p-Akt蛋白的相对表达水平均显著降低，细胞核内NF-κB p65蛋白的相对表达水平均显著升高，说明消癥汤可能通过抑制PI3K/Akt信号通路以及激活NF-κB信号通路来促进子宫平滑肌瘤细胞的凋亡。
综上所述，消癥汤可能通过下调HMGB1、PI3K、p-Akt表达，上调NF-κB p65表达，进而抑制子宫平滑肌瘤细胞的增殖和迁移，并促使其凋亡。
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（收稿日期：2021-04-20 修回日期：2021-08-25）
（編辑：邹丽娟）
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.20.04
摘 要 目的：初步研究消癥汤对大鼠子宫平滑肌瘤细胞增殖和迁移的影响及作用机制。方法：将雌性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、化学药阳性对照组（米非司酮片2.25 mg/kg）、中药阳性对照组（桂枝茯苓胶囊200 mg/kg）和消癥汤低、中、高剂量组（1.4、2.8、5.6 g/kg），每组15只。除正常对照组外，其余各组大鼠均肌内注射雌激素和孕激素建立子宫平滑肌瘤模型。自建模第2天起，各给药组大鼠灌胃相应药液，正常对照组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水，每天1次，连续4个月。末次给药后，摘取子宫并观察其形态，计算子宫系数;分离培养子宫平滑肌瘤细胞或子宫平滑肌细胞，采用MTT法检测细胞增殖率，细胞划痕实验检测子宫平滑肌瘤细胞迁移率，流式细胞术检测细胞凋亡率，荧光定量聚合酶链反应技术检测细胞中高迁移率族蛋白B1（HMGB1）mRNA表达情况，酶联免疫吸附测定法检测细胞中磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、核因子κB抑制蛋白α（IκBα）、磷酸化转化生长因子β激活激酶1（p-TAK1）的表达水平，Western blot法检测细胞质内HMGB1、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、p-Akt蛋白和细胞核内核因子κB p65（NF-κB p65）蛋白的表达水平。结果：与正常对照组比较，模型组大鼠子宫肌层明显增厚，子宫平滑肌细胞明显增多且大小不一，部分区域的肌纤维排列紊乱，子宫系数和细胞中HMGB1 mRNA及其蛋白的相对表达水平均显著升高（P<0.01）。与模型组比较，消癥汤各剂量组以及各阳性对照组大鼠的子宫平滑肌层增厚等情况均有不同程度改善，子宫系数以及子宫平滑肌瘤细胞增殖率、相对迁移率和细胞中HMGB1 mRNA及其蛋白的相对表达水平，p-Akt、IκBα的表达水平，细胞质中PI3K、p-Akt蛋白的相对表达水平（除消癥汤低剂量组外）均显著降低（P<0.05或P<0.01），子宫平滑肌瘤细胞凋亡率和细胞中p-TAK1的表达水平、细胞核内NF-κB p65蛋白的相对表达水平均显著升高（P<0.05或P<0.01），且消癥汤的作用有剂量依赖的趋势。结论：消癥汤可能通过下调HMGB1、PI3K、p-Akt表达，上调NF-κB p65表达，进而抑制子宫平滑肌瘤细胞的增殖和迁移，并促使其凋亡。
关键词 消癥汤;子宫平滑肌瘤;高迁移率族蛋白B1;磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B;核因子κB;大鼠
Effects and Mechanism of Xiaozheng Decoction on the Proliferation and Migration of Uterine Leiomyoma Cells in Rat
WU Yanli，FAN Kai，KONG Shoufang，ZHAO Xiufang，OUYANG Jianghua（Dept. of Gynaecology， Qingdao Hospital of TCM， Shandong Qingdao 266033， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects and mechanism of Xiaozheng decoction on the proliferation and migration of uterine leiomyoma cells in rat. METHODS： Female SD rats were randomly divided into normal control group， model group， chemical medicine positive control group （Mifepristone tablets， 2.25 mg/kg）， TCM positive control group （Guizhi fuling capsules， 200 mg/kg）， Xiaozheng decoction low-dose， medium-dose and high-dose groups （1.4， 2.8， 5.6 g/kg）， with 15 rats in each group. Except for normal control group， other groups were given intramuscular injection of estrogen and progesterone to induce uterine leiomyomas model. On the second day after modeling， rats in administration groups were given relevant medicine intragastrically; normal control group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 4 months. After last administration， the uterus was removed and its morphology was observed; the uterine coefficient was calculated. Uterine leiomyoma cells or uterine smooth muscle cells were isolated and cultured. The proliferation rate and migration rate of cells were detected by MTT method and cell scratch test; flow cytometry was used to detect the cell apoptosis rate; mRNA expression of HMGB1 were detected by RT-qPCR. The expression of phosphorylated protein kinase B （p-Akt）， nuclear factor κB inhibitor α （IκBα） and phosphorylated transforming growth factor β-activated kinase 1 （p-TAK1） were detected by ELISA; the protein expression of HMGB1， phospholipid 3 kinase （PI3K）， p-Akt in cytoplasm and nuclear factor κB p65（NF-κB p65） in nucleus were detected by Western blot assay. RESULTS： Compared with normal control group， the myometrium of the model group was significantly thickened， the number of uterine smooth muscle cells were significantly increased and the sizes were different， the arrangement of muscle fibers in some areas was disordered， the uterine coefficient， and the relative expression of HMGB1 mRNA and protein were increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， the thickening of uterine myometrium and other symptoms were improved to different extents in Xiaozheng decoction groups and positive control groups; the uterine coefficient， cell proliferation rate， migration rate， mRNA and protein expression of HMGB1， the expression of p-Akt and IκBα， protein expression of PI3K and p-Akt （except for Xiaozheng decoction low-dose group） in cytoplasm were all decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; the cell apoptosis rate， the expression of p-TAK1， protein expression of NF-κB p65 in nucleus were all increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The effects of Xiaozheng decoction showed a dose-dependent trend. CONCLUSIONS： Xiaozheng decoction can inhibit the proliferation and migration of uterine leiomyoma cells by down-regulating the expression of HMGB1， PI3K and p-Akt， up-regulating the expression of NF-κB p65， so as to promote cell apoptosis. KEYWORDS Xiaozheng decoction; Uterine leiomyoma; HMGB1; PI3K/Akt; NF-κB; Rat
子宫平滑肌瘤是一种由雌激素水平过高引起的平滑肌细胞良性增生，临床表现为下腹部疼痛、月经周期缩短、白带增多、经量增多和经期延长等。子宫平滑肌瘤虽然是一种良性肿瘤，但是如果不及时治疗，还是会对患者身体造成极大的损伤，甚至可能导致不孕[1]。目前，除了手术治疗[2]外，还有多种中药[3-4]和化学药[5-6]在实验室和临床上被证实可以有效缓解和治疗子宫平滑肌瘤。与化学药治疗相比，传统的中药因具有副作用少、来源广泛等优点，被临床广泛关注和使用。
高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是一种高度保守的核蛋白，在哺乳动物细胞中普遍表达。有研究指出，HMGB1可通过激活促炎性细胞因子[肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）等]来参与脓毒症、类风湿性关节炎、结肠炎和急性肺损伤等多种疾病的晚期炎症反应[7-10]。此外，HMGB1在子宫平滑肌瘤和子宫内膜癌组织中呈高表达[11]，并且可能对子宫平滑肌瘤细胞的增殖具有一定的促进作用[12]。有研究表明，干扰HMGB1蛋白的表达可以抑制膀胱癌细胞和血管瘤内皮细胞的增殖，并诱导其凋亡[13-14]。
细胞内应激与凋亡反应可以程序性地诱导细胞凋亡或自噬，进而引起多种组织损伤[15]。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路是细胞内重要的信号转导通路之一，可调控包括HMGB1在内的多种蛋白的表达，同时也参与调节细胞内应激与凋亡反应[16-18]。核因子κB（NF-κB）可通过调控细胞核内基因的转录，参与细胞对应激等刺激的反应[19]。有研究表明，通过直接控制或间接调控PI3K/Akt和NF-κB信号通路的激活，可以有效缓解细胞应激产生的负面影响，如炎症等[19-20]。
消癥汤由半枝莲、白花蛇舌草、三棱、莪术、乳香、没药、橘核、皂角刺、海藻、牡蛎、石见穿和荔枝核等药材组成，具有清热利湿、活血止癥的功效[21]。在该汤剂中，半枝莲、石见穿和白花蛇舌草是中医常用的抗癌药物，三棱、莪术、乳香、没药可理气行血、活血化瘀，橘核、荔枝核可祛寒止痛、散结消肿，皂角刺可消肿排脓、疏通经络，海藻可化痰消肿、软坚散结，牡蛎可镇惊安神、滋阴补虚[21]。前期临床研究发现，消癥汤可有效缩小患者子宫平滑肌瘤大小，可减轻其焦虑以及改善其贫血，且复发率明显低于化学药米非司酮[21]。但消癥汤抑制子宫平滑肌瘤细胞的机制尚未明确。为此，本研究拟基于HMGB1表达以及PI3K/Akt、NF-κB信号通路初步探讨消癥汤抑制子宫平滑肌瘤细胞增殖和迁移的作用机制，以期为该方在子宫平滑肌瘤临床治疗中的应用提供参考。
1 材料
1.1 主要仪器
本研究所用主要仪器包括Form Steri-Cycle型CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司），Axio Vert.A1型倒置光学显微镜（德国Zeiss公司），DYCP-31DN型电泳仪、DYCZ-40D型转膜仪（北京六一生物科技有限公司），Amersham ImageQuant 800型多功能成像仪（美国GE公司），HHM-SY96S型多功能酶标仪（深圳恒美生物技术有限公司），Guava easyCyte HT型流式细胞仪（美国Millipore公司），LightCycler480型荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析仪（瑞士Roche公司）等。
1.2 主要药品与试剂
米非司酮片（批号43050609，规格25 mg）购自华润紫竹药业有限公司;桂枝茯苓胶囊（批号120805，规格0.31 g）购自江苏康缘药业股份有限公司;MTT、Ⅰ型胶原酶、0.25%胰酶、胎牛血清（批号分别为M6494、17100017、25200072、10099141）均购自美国Gibco公司;青霉素-链霉素双抗溶液、DMEM/F12培养基（批号分别为J130061、SH30023.01B）均购自美国Hyclone公司;台盼蓝溶液（批号R03130101）购自友康恒业生物科技（北京）有限公司;D-Hanks试液（批号20150504）购自北京索莱宝科技有限公司;膜联蛋白Ⅴ-别藻蓝蛋白（Annexin Ⅴ- APC）细胞凋亡检测试剂盒（含结合缓冲液，批号20151218）购自江苏凯基生物技术股份有限公司;二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒、ECL发光液（批号分别为23225、32209）均购自美国Thermo Fisher Scientific公司;脱脂奶粉（批号P0216）购自上海碧云天生物技术有限公司;兔源HMGB1多克隆抗体、小鼠源β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体、小鼠源PI3K单克隆抗体、兔源磷酸化Akt（p-Akt）多克隆抗体、兔源NF-κB p65多克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔源核纤层蛋白B1（lamin B1）单克隆抗体、HRP标记的免疫球蛋白G二抗（批号分别为ab18256、ab8226、ab140307、ab183894、ab16502、ab194109、ab6721）均購自英国Abcam公司;RNA提取试剂SuperfecTRI total RNA isolation reagent（批号3101-400）购自上海普飞生物技术有限公司;M-MLV反转录试剂盒（批号28025013）购自美国Promega公司;ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（批号7E303A9）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;HMGB1和β-actin引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司设计、合成;PathScan? Antibody Array试剂盒（批号12856S）购自美国Cell Signaling Technology公司;其余试剂均为实验室常用规格或分析纯，水为超纯水。 半枝莲、白花蛇舌草、三棱、莪术、乳香、没药、橘核、皂角刺、海藻、牡蛎、石见穿和荔枝核饮片均由青岛市中医医院提供，经青岛市中医医院主任药师丁月方鉴定均为真品。
1.3 实验动物
本研究所用动物为SPF级SD大鼠，共105只，3月龄，雌性，体质量为（285.0±16.5）g，由青岛医科大学附属医院实验动物中心提供，动物使用许可证号为SYXK（鲁）2019-0022。本实验方案通过动物伦理委员会批准和审核，并严格按照青岛医科大学附属医院关于实验动物使用和保护的相关规定进行操作。
2 方法
2.1 消癥汤的配制
按消癥汤处方比例称取半枝莲15 g、白花蛇舌草15 g、三棱10 g、莪术10 g、（制）乳香4 g、（制）没药4 g、橘核10 g、皂角刺15 g、海藻30 g、牡蛎（先煎）30 g、石见穿15 g和荔枝核10 g，加水300 mL煎煮，煮沸后再文火煎煮10 min，收集药液;药渣再加水200 mL，煮沸后再文火煎煮30 min，收集药液，合并后滤过，将滤液浓缩至112 mL（以生药总量计质量浓度为1.5 g/mL），即得。
2.2 分组、造模与给药
将105只大鼠隨机分为正常对照组、模型组、化学药阳性对照组（米非司酮片2.25 mg/kg[22]）、中药阳性对照组（桂枝茯苓胶囊200 mg/kg[23]）和消癥汤低、中、高剂量组（1.4、2.8、5.6 g/kg，分别按临床成人用药量的0.5、1、2倍换算而得），每组15只。采用肌内注射雌激素和孕激素的方法建立大鼠子宫平滑肌瘤模型[24]：除正常对照组大鼠肌内注射等体积生理盐水外，其余各组大鼠同时肌内注射己烯雌酚（用大豆油稀释至0.4 mg/mL）0.1 mL+黄体酮（用大豆油稀释至10 mg/mL）0.1 mL，每周1次，连续15周。自建模第2天起，各给药组大鼠灌胃相应药液（用生理盐水稀释），正常对照组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水，每天1次，连续4个月。
2.3 大鼠子宫形态的观察与子宫系数的检测
末次给药后，称定各组大鼠体质量后断头处死，摘取子宫，称定子宫质量后，分别以肉眼和显微镜观察子宫形态，并计算子宫系数：子宫系数（mg/g）=子宫质量/体质量。
2.4 大鼠子宫平滑肌细胞/子宫平滑肌瘤细胞的培养
参照文献[25-26]方法制备、培养大鼠子宫平滑肌细胞/子宫平滑肌瘤细胞：在无菌条件下，取正常对照组大鼠的子宫平滑肌组织或模型组、各给药组大鼠的子宫平滑肌瘤组织，利用无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2，下同）冲洗表面3次，取1～2 cm3的组织置于无菌培养皿中，剪碎成1 mm3的小块，加入混合消化液（含0.25%Ⅰ型胶原酶和0.25%胰酶）3 mL，在37 ℃下消化1 h，再加入含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基2 mL终止消化，过200目细胞筛，弃去组织块，以1 000 r/min离心10 min，取上清液置于35 mm培养皿中，在37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。收集第1代和第2代细胞，用台盼蓝染色，检测细胞存活情况。
2.5 大鼠子宫平滑肌瘤细胞增殖率的检测
采用MTT法进行检测。将从各组大鼠体内分离到的且处于对数生长期的子宫平滑肌细胞或子宫平滑肌瘤细胞以1×105个/孔接种于96孔板中，每组设6个复孔，其中3个孔直接加入MTT溶液10 μL ，另外3个孔置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养48 h，于实验终止前加入MTT溶液10 μL 。加入MTT溶液后，各孔均继续培养4 h，再加入二甲基亚砜150 μL终止反应，振荡10 min，利用酶标仪于490 nm波长处测定各孔的吸光度值（A）并计算细胞增殖率：细胞增殖率=（实验组48 h时的A值-实验组0 h时的A值）/（正常对照组48 h时的A值-正常对照组0 h时的A值）×100%。
2.6 大鼠子宫平滑肌瘤细胞相对迁移率的检测
采用细胞划痕实验进行检测。将从模型组和各给药组大鼠体内分离到的且处于对数生长期的子宫平滑肌瘤细胞以5×105个/孔接种于6孔板中，每组设6个复孔。将各组细胞置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞贴壁且生长至70%～80%时，用200 ?L移液枪枪头垂直划出“十”字划痕，用PBS轻柔洗去未贴壁的细胞，加入DMEM/F12培养基（不含胎牛血清）适量，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养，利用倒置光学显微镜对细胞板进行拍照，记录0 h和24 h时同一位置的照片，并记录距划痕边缘一定距离的细胞数量。使用Image J v1.8.0软件计算各组细胞的相对迁移率：相对迁移率（%）=（实验组培养0 h时的细胞数量-实验组培养24 h时的细胞数量）/（模型组培养0 h时的细胞数量-模型组培养24 h时的细胞数量）×100%。实验重复3次。
2.7 大鼠子宫平滑肌瘤细胞凋亡率的检测
采用流式细胞术进行检测。将从模型组和各给药组大鼠体内分离到的且处于对数生长期的子宫平滑肌瘤细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM/F12培养基重悬，以5×105个/孔接种于6孔板中，每组设6个复孔。将各组细胞置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞贴壁且生长至70%～80%时，收集细胞至15 mL离心管（≥1×106个/管）中，以1 500 r/min离心5 min，收集细胞沉淀，用1×D-Hanks试液（pH 7.2）重悬和洗涤2次后，将1×106个细胞重悬于1×结合缓冲液中，加入Annexin Ⅴ-APC试剂10 μL，轻轻混合，在室温（25 ℃）避光条件下孵育15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况并计算凋亡率（以早期凋亡细胞计）。实验重复3次。 2.8 大鼠子宫平滑肌细胞/子宫平滑肌瘤细胞中HMGB1 mRNA表达水平的检测
采用RT-qPCR法进行检测[27]。将从各组大鼠体内分离到的且处于对数生长期的子宫平滑肌细胞或子宫平滑肌瘤细胞以1×106个/孔接种于6孔板中，每组设3个复孔。将各组细胞置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h后，收集细胞至1.5 mL无DNA/RNA酶离心管中，提取各组细胞的总RNA，按照反转录试剂盒说明书方法操作，将RNA反转录成cDNA。以上述cDNA为模板，用焦碳酸二乙酯（DEPC）水稀释10倍后进行扩增。扩增体系（20 ?L）包括2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 ?L，上、下游引物（10 ?mol/L）各0.4 ?L，cDNA模板5 ?L，加水至10 ?L。扩增条件如下：95 ℃预变性3 min;95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。HMGB1的上游引物序列为5′-GATGACAAGCAGCCCTAT-3′，下游引物序列为5′-TCCATGCCAATTTACAAC-3′，产物片段大小为481 bp;β-actin的上游引物序列为5′-TCAGGTCATCACTATCGGC- AAT-3′，下游引物序列为5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′，产物片段大小为432 bp。利用2-ΔΔCt法进行分析，将每组所测得的HMGB1 cDNA拷贝数分别与β-actin相比，再将所得值与正常对照组相比，以两者相对拷贝数比值表示HMGB1 mRNA的相对表达水平。实验重复3次。
2.9 大鼠子宫平滑肌瘤细胞中p-Akt、NF-κB抑制蛋白α、磷酸化转化生长因子β激活激酶1表达水平的检测
利用PathScan? Antibody Array试剂盒以酶联免疫吸附测定法进行检测。实验参考文献[28]进行操作：将从模型组和各给药组大鼠体内分离到的且处于对数生长期的子宫平滑肌瘤细胞以1×106个/孔接种于6孔板中，每组设3个复孔。将各组细胞置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h后，收集细胞，加入裂解液提取细胞总蛋白，利用BCA蛋白定量法计算各组样品的总蛋白量;将总蛋白置于玻片上，使用试剂盒内的生物素化细胞应激与凋亡通路相关细胞因子抗体混合物进行孵育，依次加入试剂盒中的Streptavidin-conjugated HRP和LumiGLO?化學发光液显影。利用多功能成像仪成像并用Image J v1.8.0软件进行分析，以灰度值表示p-Akt、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）、磷酸化转化生长因子β激活激酶1（p-TAK1）的表达水平。实验重复3次。
2.10 大鼠子宫平滑肌瘤细胞中HMGB1、PI3K、p-Akt和NF-κB p65蛋白表达水平的检测
采用Western blot法进行检测。将从各组大鼠体内分离到的且处于对数生长期的子宫平滑肌瘤细胞以1×106个/孔接种于6孔板中，每组设3个复孔。将各组细胞置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h后，收集细胞，加入裂解液提取细胞总蛋白，利用BCA蛋白定量法计算各组样品的总蛋白量，并将蛋白煮沸变性;取变性蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，并用含5%脱脂奶粉的PBST溶液室温封闭2 h;加入HMGB1、PI3K、p-Akt、NF-κB p65、β-actin（用于检测细胞质中蛋白表达的内参）和lamin B1（用于检测细胞核中蛋白表达的内参）一抗（稀释比例均为1 ∶ 2 000），4 ℃下孵育过夜;用TBST溶液清洗3次后，加入HRP标记的免疫球蛋白G二抗（稀释比例为1 ∶ 5 000），室温孵育1 h;用TBST溶液清洗3次后，加入ECL发光液显影。利用多功能成像仪成像并用Image J v1.8.0软件分析，计算目标蛋白与内参蛋白的灰度值比值，再与模型组进行比较，用以表示目标蛋白的相对表达水平。实验重复3次。
2.11 统计学方法
采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。检验水准α=0.05。
3 结果
3.1 大鼠子宫形态与子宫系数变化
正常对照组大鼠子宫肌层正常，子宫平滑肌细胞结构完整、分布均匀。与正常对照组比较，模型组大鼠子宫肌层明显增厚，子宫平滑肌细胞明显增多且大小不一，部分区域的肌纤维排列紊乱;消癥汤中、高剂量组和化学药阳性对照组、中药阳性对照组大鼠子宫肌层未见明显增厚，子宫平滑肌细胞分布较均匀;消癥汤低剂量组大鼠子宫肌层有所增厚，但厚度低于模型组，子宫平滑肌细胞数增加，但少于模型组。
与正常对照组比较，模型组大鼠的子宫系数显著升高（P<0.01）。与模型组比较，消癥汤各剂量组和各阳性对照组大鼠的子宫系数均显著降低（P<0.01），且消癥汤的作用有剂量依赖趋势。结果见表1。
3.2 大鼠子宫平滑肌细胞/子宫平滑肌瘤细胞的存活情况
大鼠子宫平滑肌细胞/子宫平滑肌瘤细胞均生长良好，活细胞比例达98%，具体表现为细胞界限清楚，细胞无破裂，平滑肌细胞呈长梭形或长形，平滑肌瘤细胞密集呈梭形或椭圆形，背景中基本无细胞碎片，细胞无污染。结果见图1。
3.3 消癥汤对大鼠子宫平滑肌瘤细胞增殖的影响
与模型组比较，消癥汤各剂量组和各阳性对照组大鼠子宫平滑肌瘤细胞的增殖率均显著降低（P<0.05或P<0.01），且消癥汤的作用有剂量依赖趋势（见图2）。
3.4 消癥汤对大鼠子宫平滑肌瘤细胞相对迁移率的影响
与模型组比较，消癥汤各剂量组和各阳性对照组大鼠子宫平滑肌瘤细胞的相对迁移率均显著降低（P<0.01），且消癥汤的作用有剂量依赖趋势。结果见表2、图3。 3.5 消癥汤对大鼠子宫平滑肌瘤细胞凋亡的影响
与模型组比较，消癥汤各剂量组和各阳性对照组大鼠子宫平滑肌瘤细胞的凋亡率均显著升高（P<0.01），且消癥汤的作用有剂量依赖趋势。结果见图4、图5。
3.6 消癥汤对大鼠子宫平滑肌瘤细胞细胞质中HMGB1 mRNA及其蛋白表达的影响
与正常对照组比较，模型组大鼠子宫平滑肌瘤细胞细胞质中HMGB1 mRNA及其蛋白的相对表达水平均显著升高（P<0.01）。与模型组比较，消癥汤各剂量组和各阳性对照组大鼠子宫平滑肌瘤细胞细胞质中HMGB1 mRNA及其蛋白的相对表达水平均显著降低（P<0.05或P<0.01），且消癥汤的作用有剂量依赖趋势。结果见图6～图8。
3.7 消癥湯对大鼠子宫平滑肌瘤细胞中p-Akt、IκBα、p-TAK1表达水平的影响
与模型组比较，消癥汤各剂量组和各阳性对照组大鼠子宫平滑肌瘤细胞中p-Akt、IκBα表达水平均显著降低（P<0.05），p-TAK1表达水平均显著升高（P<0.05），且消癥汤的作用有剂量依赖趋势。结果见图9。
3.8 消癥汤对大鼠子宫平滑肌瘤细胞中PI3K、p-Akt、NF-κB p65蛋白表达的影响
与模型组比较，消癥汤各剂量组和各阳性对照组大鼠子宫平滑肌瘤细胞质中PI3K（消癥汤低剂量组除外）和p-Akt蛋白的相对表达量均显著降低（P<0.05或P<0.01），细胞核内NF-κB p65蛋白的相对表达量均显著升高（P<0.05或P<0.01），且消癥汤的作用有剂量依赖趋势。结果见图10、图11。
4 讨论
子宫平滑肌瘤是女性常见的肿瘤之一，其发生与雌激素水平以及遗传因素有关。子宫平滑肌瘤主要由子宫平滑肌细胞增生形成，当肌瘤直径小于5 cm且没有生育要求时多采用药物保守治疗。消癥汤由半枝莲、白花蛇舌草、三棱、莪术、乳香、没药、橘核、皂角刺、海藻、牡蛎、石见穿和荔枝核等药材熬制而成，不仅有活血化瘀、抗肿瘤的功效，而且可以滋阴补血，对子宫平滑肌瘤有潜在的治疗价值[21]。
细胞凋亡是一种正常有序的生理现象，是程序性细胞死亡过程，其涉及一系列调控，比如凋亡相关信号通路的激活、抗凋亡因子活性的抑制以及水解酶的活化等[29]。本研究结果显示，与模型组比较，消癥汤各剂量组和各阳性对照组大鼠的子宫系数和子宫平滑肌瘤细胞增殖率均显著降低，细胞凋亡率均显著升高，表明消癥汤对子宫平滑肌瘤细胞有明显的抑制作用。细胞划痕实验结果显示，消癥汤各剂量组和各阳性对照组大鼠子宫平滑肌瘤细胞的相对迁移率均显著低于模型组，进一步证明了消癥汤对子宫平滑肌瘤细胞具有明显的抑制作用。
已有研究显示，HMGB1在子宫平滑肌瘤等多种肿瘤组织中呈高表达，抑制其表达，可激活细胞凋亡途径，促进细胞凋亡，表明HMGB1具有作为肿瘤标志物以及预后检测指标的潜力[12-13，27]。本研究结果显示，消癥汤各剂量组大鼠子宫平滑肌瘤细胞中HMGB1 mRNA及其蛋白的相对表达水平均显著低于模型组，且随着消癥汤剂量的升高，对HMGB1表达的抑制作用有逐渐增强的趋势，说明消癥汤对子宫平滑肌瘤细胞中HMGB1的高表达具有明显的抑制作用，且有一定的剂量依赖趋势。
细胞内促凋亡与应激信号通路的活化是细胞凋亡的途径之一。已有研究发现，HMGB1、NF-κB p65在子宫内膜肿瘤组织中呈高表达，且通过下调HMGB1相关的NF-κB p65或PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路可诱导肿瘤细胞（如肝癌细胞和子宫内膜癌细胞）的凋亡[30-31]。本文利用PathScan? Antibody Array试剂盒分析了细胞中p-Akt、IκBα、p-TAK1的表达情况，结果发现，与模型组比较，消癥汤各剂量组细胞中p-Akt、IκBα表达水平均显著降低，p-TAK1表达水平均显著升高。同时，本文通过Western blot法检测了细胞中PI3K、p-Akt、NF-κB p65蛋白的表达水平，发现与模型组比较，消癥汤各剂量组细胞质中PI3K（消癥汤低剂量组除外）、p-Akt蛋白的相对表达水平均显著降低，细胞核内NF-κB p65蛋白的相对表达水平均显著升高，说明消癥汤可能通过抑制PI3K/Akt信号通路以及激活NF-κB信号通路来促进子宫平滑肌瘤细胞的凋亡。
综上所述，消癥汤可能通过下调HMGB1、PI3K、p-Akt表达，上调NF-κB p65表达，进而抑制子宫平滑肌瘤细胞的增殖和迁移，并促使其凋亡。
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（收稿日期：2021-04-20 修回日期：2021-08-25）
（編辑：邹丽娟）