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摘要 采用单因素试验和4因素3水平的正交试验相结合的方法，建立和优化甘西鼠尾草稳定的ISSR-PCR反应体系。结果表明，甘西鼠尾草20 ul ISSR-PCR体系中各因素的最佳浓度：10×Buffer（Mg2+）2 μl，dNTPs 0.4 mmol/L，Tag酶1.0 U，引物0.3 μmol/L，DNA 30 ng。
关键词 甘西鼠尾草；ISSR-PCR；优化
中图分类号 S567.23+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）27-037-02甘西鼠尾草（Salvia przewalskii Maxim.）又名高原丹参，是藏区常用的藏药（藏文译音：吉子恩保），因其有效成分与中药丹参相似，功能主治亦与丹参相同，在西南、西北地区甘西鼠尾草普遍作为临床治疗心血管疾病中药丹参的替代品种[1]。
近年来ISSR技术已应用于植物遗传分析的各个方面，如品种鉴定[2]、遗传关系及遗传多样性分析[3-4]、遗传连锁图谱的构建[5-7]等研究。为确保ISSR分析结果的可靠性和重复性，进行ISSR-PCR反应体系的建立与优化非常必要。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料。甘西鼠尾草材料，采自青海省及甘肃省8个不同的居群。
1.1.2 主要试剂与仪器。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB））（国药集团）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）Solarbio、β-巯基乙醇（AMRESCO）、EDTA（国药集团）、SDS（国药集团）、溴化乙锭（EB）Sigma、琼脂糖（GENETECH），其他试剂为国产分析纯。Tag酶、dNTP（Mg+）、10×buffer（TaKaRa）、ISSR引物由上海生工公司合成。冷冻离心机（Eppendorf）、紫外可见分光光度计（上海精科）、 凝胶成像系统（Tanon）、电泳仪（ 北京市六一仪器厂）、水浴锅（ 东方电工）。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取。
以甘西鼠尾草为材料，用改良CTAB法提取DNA。采用1.5%琼脂糖电泳，EB染色，凝胶成像系统观察并拍照，-20 ℃保存。
1.2.2 ISSR反应体系的建立与优化。
随机抽取一样品的DNA作为模板，ISSR-PCR扩增体系为：在20 μl中，内含20 ng模板DNA，1.0U Tag聚合酶，引物0.4 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，2 μl的10×Buffer（内含Mg+）。扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，在引物退火温度下退火45 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。
为了优化反应体系，针对DNA、dNTPs、TagDNA酶和引物用量等，设置了一系列的浓度梯度，进行单因素试验（表1），为进一步优化反应体系，进行正交试验L9（34）（表2）。
2 结果与分析
2.1 模板DNA用量对ISSR-PCR扩增结果的影响
由图1可知，在20 μl反应体系中，模板DNA浓度在10～50 ng均能扩增出条带，由此可知，DNA模板浓度对扩增结果影响较小，根据条带的模糊和缺失与否，最终选用30 ng作为适宜的模板浓度。
2.2 dNTPs用量对ISSR-PCR扩增结果的影响
由图2可知，在20 μl反应体系中，dNTPs浓度为0.4 mmol/L时，条带最为清晰，因此选用0.4 mmoI/L作为适宜的dNTPs浓度。
2.3 引物浓度对ISSR扩增结果的影响
由图3可知，引物浓度在0.2～0.5 μmol/L时，扩增效率高，谱带比较全面。综合考虑，最终选用0.4 μmol/L为适宜的引物浓度。
2.4 TagDNA聚合酶剂量对ISSR-PCR扩增结果的影响
由图4可知，TagDNA酶用量在0.75～1.25 U时均可以得到重复清晰的条带，且无特异性扩增。从经济适用的角度考虑，确定1.0 U/20 μl为适宜TagDNA聚合酶浓度。
2.5 甘西鼠尾草ISSR-PCR反应体系正交试验结果
由图5可知，在9个处理中，第4号处理扩增效果最好，谱带强，多
态性高。因此甘西鼠尾草最佳ISSR扩增反应条件为：反应体系10×Buffer 2 μl，DNA模板为30 ng，Primer为0.3 μmol/L，
TagDNA聚合酶为1.0 U，dNTPs 0.4 mmol/L，无菌双蒸水补足20 μl。
3 讨论
ISSR-PCR反应体系的影响因素较多，该试验在前期进行了大量的预试验工作，因此在反应条件的摸索上较为顺利，最终确定适用于甘西鼠尾草20 μl ISSR-PCR体系中各因素的最佳浓度：10×Buffer（Mg2+）2 μl，dNTPs 0.4 mmol/L，Tag酶1.0 U，引物0.3 μmol/L，DNA 30 ng。此外，在试验过程中发现，对同一样品使用不同厂家的Tag酶，PCR扩增效果会有较明显的区别。DNA模板的质量也直接影响试验结果，在试验前应充分保证DNA模板的纯度。
参考文献
[1] 翁裕馨，李成义.中藏药材甘西鼠尾草的研究进展[J].中国民族民间医药，2010，2（2）：19.
[2] GOULAO L，OLIVEIRA C M.Molecular characterization of cultivars of apple（Malus×domestica Borkh.）using microsatellite（SSR and ISSR）markers[J].Euphytica，2001，122：81-89.
[3] 余爱丽，张木清，陈如凯.ISSR分子标记在甘蔗及其近缘属分类上的应用[J].福建农林大学学报（自然科学版），2002，31（4）：484.
[4] 祁建民，周东新，吴为人，等.用ISSR标记检测黄麻野生种与栽培种遗传多样性[J].应用生态学报，2003，14（9）：1473.
[5] 劉华消.ISSR标记在水稻分子遗传图谱构建和稻米蒸煮品质QTL定位上的应用[D].福建：福建农林大学，1998.
[6] ROUSE M L，FENG D，CHENG F S，et al.Mapping the citrus genome[J].Acta-horticulturae，2000，535：25.
[7] SANKAR A A，MOORE G A.Evaluation of inter-simple sequence repeat analysis for mapping in Citrus andextension of the genetic linkage map[J].Theoretical and applied genetics，2001，102：206.
关键词 甘西鼠尾草；ISSR-PCR；优化
中图分类号 S567.23+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）27-037-02甘西鼠尾草（Salvia przewalskii Maxim.）又名高原丹参，是藏区常用的藏药（藏文译音：吉子恩保），因其有效成分与中药丹参相似，功能主治亦与丹参相同，在西南、西北地区甘西鼠尾草普遍作为临床治疗心血管疾病中药丹参的替代品种[1]。
近年来ISSR技术已应用于植物遗传分析的各个方面，如品种鉴定[2]、遗传关系及遗传多样性分析[3-4]、遗传连锁图谱的构建[5-7]等研究。为确保ISSR分析结果的可靠性和重复性，进行ISSR-PCR反应体系的建立与优化非常必要。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料。甘西鼠尾草材料，采自青海省及甘肃省8个不同的居群。
1.1.2 主要试剂与仪器。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB））（国药集团）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）Solarbio、β-巯基乙醇（AMRESCO）、EDTA（国药集团）、SDS（国药集团）、溴化乙锭（EB）Sigma、琼脂糖（GENETECH），其他试剂为国产分析纯。Tag酶、dNTP（Mg+）、10×buffer（TaKaRa）、ISSR引物由上海生工公司合成。冷冻离心机（Eppendorf）、紫外可见分光光度计（上海精科）、 凝胶成像系统（Tanon）、电泳仪（ 北京市六一仪器厂）、水浴锅（ 东方电工）。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取。
以甘西鼠尾草为材料，用改良CTAB法提取DNA。采用1.5%琼脂糖电泳，EB染色，凝胶成像系统观察并拍照，-20 ℃保存。
1.2.2 ISSR反应体系的建立与优化。
随机抽取一样品的DNA作为模板，ISSR-PCR扩增体系为：在20 μl中，内含20 ng模板DNA，1.0U Tag聚合酶，引物0.4 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，2 μl的10×Buffer（内含Mg+）。扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，在引物退火温度下退火45 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。
为了优化反应体系，针对DNA、dNTPs、TagDNA酶和引物用量等，设置了一系列的浓度梯度，进行单因素试验（表1），为进一步优化反应体系，进行正交试验L9（34）（表2）。
2 结果与分析
2.1 模板DNA用量对ISSR-PCR扩增结果的影响
由图1可知，在20 μl反应体系中，模板DNA浓度在10～50 ng均能扩增出条带，由此可知，DNA模板浓度对扩增结果影响较小，根据条带的模糊和缺失与否，最终选用30 ng作为适宜的模板浓度。
2.2 dNTPs用量对ISSR-PCR扩增结果的影响
由图2可知，在20 μl反应体系中，dNTPs浓度为0.4 mmol/L时，条带最为清晰，因此选用0.4 mmoI/L作为适宜的dNTPs浓度。
2.3 引物浓度对ISSR扩增结果的影响
由图3可知，引物浓度在0.2～0.5 μmol/L时，扩增效率高，谱带比较全面。综合考虑，最终选用0.4 μmol/L为适宜的引物浓度。
2.4 TagDNA聚合酶剂量对ISSR-PCR扩增结果的影响
由图4可知，TagDNA酶用量在0.75～1.25 U时均可以得到重复清晰的条带，且无特异性扩增。从经济适用的角度考虑，确定1.0 U/20 μl为适宜TagDNA聚合酶浓度。
2.5 甘西鼠尾草ISSR-PCR反应体系正交试验结果
由图5可知，在9个处理中，第4号处理扩增效果最好，谱带强，多
态性高。因此甘西鼠尾草最佳ISSR扩增反应条件为：反应体系10×Buffer 2 μl，DNA模板为30 ng，Primer为0.3 μmol/L，
TagDNA聚合酶为1.0 U，dNTPs 0.4 mmol/L，无菌双蒸水补足20 μl。
3 讨论
ISSR-PCR反应体系的影响因素较多，该试验在前期进行了大量的预试验工作，因此在反应条件的摸索上较为顺利，最终确定适用于甘西鼠尾草20 μl ISSR-PCR体系中各因素的最佳浓度：10×Buffer（Mg2+）2 μl，dNTPs 0.4 mmol/L，Tag酶1.0 U，引物0.3 μmol/L，DNA 30 ng。此外，在试验过程中发现，对同一样品使用不同厂家的Tag酶，PCR扩增效果会有较明显的区别。DNA模板的质量也直接影响试验结果，在试验前应充分保证DNA模板的纯度。
参考文献
[1] 翁裕馨，李成义.中藏药材甘西鼠尾草的研究进展[J].中国民族民间医药，2010，2（2）：19.
[2] GOULAO L，OLIVEIRA C M.Molecular characterization of cultivars of apple（Malus×domestica Borkh.）using microsatellite（SSR and ISSR）markers[J].Euphytica，2001，122：81-89.
[3] 余爱丽，张木清，陈如凯.ISSR分子标记在甘蔗及其近缘属分类上的应用[J].福建农林大学学报（自然科学版），2002，31（4）：484.
[4] 祁建民，周东新，吴为人，等.用ISSR标记检测黄麻野生种与栽培种遗传多样性[J].应用生态学报，2003，14（9）：1473.
[5] 劉华消.ISSR标记在水稻分子遗传图谱构建和稻米蒸煮品质QTL定位上的应用[D].福建：福建农林大学，1998.
[6] ROUSE M L，FENG D，CHENG F S，et al.Mapping the citrus genome[J].Acta-horticulturae，2000，535：25.
[7] SANKAR A A，MOORE G A.Evaluation of inter-simple sequence repeat analysis for mapping in Citrus andextension of the genetic linkage map[J].Theoretical and applied genetics，2001，102：206.