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【摘要】 目的 探讨胸苷酸合成酶(TS)在直肠癌组织中的表达及其临床意义。方法 用免疫组化SP法检测48例结肠直肠癌组织中TS的表达,用Kap lan-Meier法分析TS的表达与临床病理特征和预后的相关性。用多因素COX模型分析影响患者预后的相关因素。结果 TS在癌组织中阳性表达率高于正常组织和癌旁组织;中晚期阳性表达率高于早期病例;低分中阳性表达率高于高分化组织;2年复发组中阳性表达率高于非复发组(P<0.05)。多因素分析显示TS是影响预后的重要因素。结论 TS可以作为判断直肠癌恶性程度、对5-FU耐药情况以及预测预后的重要参考指标。
【关键词】直肠癌; 胸苷酸合成酶;免疫组化
Expression of thymidylate synthase in rectal cancer and its clinical significance
ZOU Jin-lin,SUN Hua-bin, YING Fang, et al.
Department of General Surgery,The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University,Guangdong,Zhuhai 519000,China
【Abstract】 Objective To investigate Expression of thymidylate synthase(TS) in rectal cancer and its clinical significance.Methods Expression of TS was observed in 48 cases of rectal cancer (RC) tissues using immunohistochemical staining. Kaplan-Meier survival analysis was used to analyze the correlation of the expression of TS with the clinicopathologic parameters and prognosis of RC patients. Multiple COX proportional hazards model analysis was used to analyze the prognostic factors. Results The expression level of TS in RC tissues was higher than normal and RC sideward tissues,and in lower degree of tumor differentiation than in high degree,at early stage cases was higher than at advanced case. The expression level of TS in the cases with recrudescence in 2-year was high than in the cases without recrudescence in 2-year(P<0.05).Multiple analysis showed that TS expression was independent prognostic factors for RC. Conclusion The expression of TS is a significant prognostic factors for RC,and can be regarded as a index for estimating the m alignant degree of RC and resistant 5-FU.
【Key words】 Rectal cancer;Thymidylate synthase;Immunohistochemistry
直肠癌是临床上常见的消化道肿瘤,由于隐蔽于肠道,早期难以发现,多数患者就诊时已经是中晚期病例,化疗是不可缺少的治疗手段之一,而肿瘤对化疗药物的耐药往往是肿瘤复发的重要原因之一。5-FU类药物是结肠直肠癌化疗的基本用药之一。胸苷酸合成酶( thymidylate synthase,TS)是5-FU作用的靶酶,TS的作用是催化脱氧尿嘧啶核苷酸转化为脱氧胸苷酸,它是DNA合成所必需的成分,其结果是破坏了细胞内DNA合成的核苷酸池,影响了DNA的合成,导致肿瘤细胞死亡。本研究目的在于通过检测耐药相关基因TS在直肠癌组织中的表达情况,探讨TS在直肠癌的表达的及否可以预测肿瘤耐药情况。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本院从2004年7月至2006年7月对48例直肠癌患者的病理标本切片进行TS免疫组化检查。全组男33例,女15例,年龄23～83岁,平均(50±3.2)岁。全组管状腺癌22例,乳头状腺癌13例,粘液腺癌(包括印戒细胞癌)13例。分DukesA期7例,期DukesB期21例,DukesC期20例。按照直肠癌部位:高位13例、中位21例、低位14例。分化程度:高分化20例,中分化17例,低分化11例。所有病例均行根治性手术及FOLFOX4方案初次化疗。具体临床病理资料详见附表1。
1.2 主要试剂和仪器 鼠抗人TS单克隆抗体、DAB 显色试剂盒,SP 试剂盒均为迈新公司产品。主要仪器有显微镜、切片机、烤箱、染色缸、湿盒。
1.3 实验方法 分别标本的正常部分肠管壁、癌旁组织和癌组织进行取材并固定,分别取肿瘤组织约2 cm×2 cm×0.5 cm 大小去除坏死组织,置于10%中性缓冲甲醛溶液固定24 h,常规石蜡包埋。常规石蜡切片做4μm 连续切片,展开后捞片,置烤箱中60℃烤片3 h。免疫组化染色采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。实验对照采用SP法,操作严格按照上述步骤要求进行,以PBS 缓冲代替一抗作为阴性对照。
1.4 TS表达的判断标准:以胞浆/胞核出现棕黄色颗粒为阳性,根据表达阳性细胞数的百分比判定TS蛋白表达高低,计算4个具有代表性的高倍视野中100个细胞中阳性细胞的百分数。-:<10%;+:10%～50%;++:>50%。判定阳性细胞数>50%为TS高表达,<50%为TS低表达。
1.5 统计学方法 采用SPSS 10.0软件分析。应用四格表的 χ2检验分析结直肠癌组织TS的表达和临床病理特征的相关性,用Kap lan-Merier法比较生存情况,并进行log-rank检验,多因素COX比例风险模型进行预后的多因素分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 TS在正常部分的肠管、癌旁组织和癌组织中的表达情况:TS在三部分组织中均有阳性表达,正常、癌旁和癌组织TS阳性表达率分别为:54.2%、72.9%和89.6%( χ2=14.858,P=0.001),其中高表达率分别为:16.7%、27.1%和47.9%( χ2=30.713,P=0.000)。提示:TS在上述三部分组织中的表达有显著性差异,且离癌组织越近高表达率越高(P<0.05),详见表1。
2.2 TS的表达与肿瘤分期的关系 TS在Dukes A、B、C三期的阳性表达率分别为:42.9%、66.7%和85%,其中高表达率分别为14.3%、38.1%和60%提示TS在早期表达率较低,在中晚期表达率较高(P<0.05),详见表1。
2.3 TS的表达与肿瘤组织学类型的关系 TS在管状腺癌、乳头状和粘液性腺癌中的阳性表达率和高表达率分别为:63.6%、61.5%、69.2%和31.8%、30.8%、38.5%,提示三种类型的TS表达率无显著性差异(P>0.05),详见表1。
2.4 TS的表达与组织分化程度的关系
TS在低分化、中分化和高分化中的阳性表达率和高表达率分别为:92.9%、76.2%、53.9%和64.3%、23.8%、15.8%,提示低分化中TS阳性表达率和高表达率均明显高于高分化中(P<0.05),详见附表1。
2.5 TS的表达与2年内肿瘤复发的关系本组病例2年内复发率为33.3%(16/48),TS在复发组和非复发组的阳性表达率和高表达率分别为:87.5%、46.9%(P=0.007)和56.3%、21.9%(P=0.017),提示复发组TS的表达率和高表达率明显高于未复发者(P<0.05),详见附表1。
表1
TS的表达与直肠癌的临床病理参数关系(例,%)
项目例数TS
-+++P值
正常部分肠壁组织4822(45.8)18(37.5)8(16.7)<0.05
癌旁组织4813(27.1)22(45.8)13(27.1)
癌组织485(10.4)20(41.7)23(47.9)
Dukes分期
A74(57.1)2(28.6)1(14.3)
B217(33.3)6(28.6)8(38.1)
C203(15)5(25)12(60)<0.05
病理类型:
管状腺癌228(36.4)7(31.8)7(31.8)
乳头状腺癌135 (38.5)4(30.8)4(30.8)
粘液性腺癌134(30.8)4(30.8)5(38.5)>0.05
分化程度:
低分化141(7.1)4(28.6)9(64.3)
中分化215(23.8)11(53.4)5(23.8)
高分化136(46.1)5(38.5)2(15.4)<0.05
2年内复发与否
是16(33.33)2(12.5)5(31.3)9(56.3)
否32(66.7)17(53.1)8(25)7(21.9)<0.05
2.6 TS表达及临床病理因素与直肠癌预后的分析 Kap lan-Meier单因素分析显示,Dukes分期、组织分化程度、TS表达率和预后具有相关性。DukesA期直肠癌的预后明显优于晚期直肠癌Dukes C期(P<0.01)。高分化腺癌预后优于低分化腺癌(P<0.01)。TS低表达者预后明显优于高表达者(P<0.05) 。
2.7 直肠癌预后的多因素COX比例风险模型分析 将年龄、性别、临床分期、组织学类型、组织分化程度和TS的表达一起引入风险回归模型进行预后的多因素分析,结果显示:临床分期、组织分化程度和TS的表达是影响预后的重要因素(见表2)。
表2
直肠癌症预后的多因素COX比例风险模型分析
因素回归系数标准误Wald检验值P值
相对危险度
年龄0.013 80.660 10.014 40.700 20.732 7
性别0.021 40.725 30.823 30.655 30.765 1
临床分期0.717 30.311 37.508 10.005 32.330 7
病理类型0.089 90.447 20.035 40.641 60.880 3
组织分化程度0.797 00.280 15.371 30.030 42.515 1
TS表达0.783 30.334 17.110 30.021 3
2.397 3
3 讨论
本研究显示:TS在癌组织中阳性表达率高于正常组织和癌旁组织;中晚期阳性表达率高于早期病例;低分中阳性表达率高于高分化组织;2年复发组中阳性表达率高于非复发组(P<0.05)。TS在癌组织高表达率47.9%和在2年内复发病例高表达率为56.3%提示TS的高表达率与肿瘤复发有着密切关系,可能与TS高表达率病例更容易出现对5-FU耐药有关。TS 5’-UTR 28bp 3R /3R基因型患者对5-FU的化疗有效率低于2R /2R、2R /3R基因型,其机制认为TS基因5’-UTR多态性影响了正常组织和肿瘤组织的TS mRNA表达[1] ,3R /3R基因型患者的TS mRNA表达明显高于2R /2R、2R /3R组[2],导致前者有较高的TS蛋白表达,高表达TS蛋白对FdUMP有较高的IC50(50%)抑制浓度)值,使FdUMP不能有效的抑制TS,影响肿瘤细胞DNA的合成[3],使5-FU治疗疗效差,肿瘤更容易复发。TS及DPD mRNA水平对应用5 - 氟脲嘧啶治疗胃肠癌的疗效具有一定预测价值,TS5’-UTR 3R /3R基因型的检测对于预测患者对5-FU为主的化疗疗效有参考价值,TS的表达状况是影响预后的参考指标[4-6]。本研究显示TS不仅与肿瘤恶性程度有关,而且是一个影响预后的重要因素。
参考文献
[1] Toriumi F,Kubota T,Saikawa Y,et al. Thymidylate synthetase (TS) genotype and S/dihydropyrimidinedehydrogenase mRNA level as an indicator in determining chemosensitivity to 5-fluorouracil in advanced gastric carcinoma. Anticancer Res,2004,24(4):2455-2463.
[2] Mandola MV,Stoehlmacher J,Zhang W,et al. A 6bp polymorphism in the thymidylate synthaes gene causes message instability and is associated with decreased intratumoral TS mRNA levels. Pharmacogenetics,2004,14(5):319-327.
[3] KanekoM,Kawakami K,Ovama K,et al. The association of expression and gene polymorphism of the thymidylate synthase gene with 5-fluoro-5’-deoxyuridine sensitivity in gastric cancer cell lines. Gan To Kaqaku Ryoho,2004,31 (9) : 1347-1350.
[4] 董秋美,何友兼,郑伟华,等.结直肠癌组织胸苷酸合成酶的表达及临床意义.肿瘤,2007,27(11):907-909.
[5] 赵晶,张景然,赵利红.TS、DPD表达水平对5-FU疗效的预测价值.放射免疫学杂志.2007,20(1):63-65
[6] 轩菡,顾康生,冯继峰,等.床肿瘤学杂志,2008,13(7):594-597.
【关键词】直肠癌; 胸苷酸合成酶;免疫组化
Expression of thymidylate synthase in rectal cancer and its clinical significance
ZOU Jin-lin,SUN Hua-bin, YING Fang, et al.
Department of General Surgery,The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University,Guangdong,Zhuhai 519000,China
【Abstract】 Objective To investigate Expression of thymidylate synthase(TS) in rectal cancer and its clinical significance.Methods Expression of TS was observed in 48 cases of rectal cancer (RC) tissues using immunohistochemical staining. Kaplan-Meier survival analysis was used to analyze the correlation of the expression of TS with the clinicopathologic parameters and prognosis of RC patients. Multiple COX proportional hazards model analysis was used to analyze the prognostic factors. Results The expression level of TS in RC tissues was higher than normal and RC sideward tissues,and in lower degree of tumor differentiation than in high degree,at early stage cases was higher than at advanced case. The expression level of TS in the cases with recrudescence in 2-year was high than in the cases without recrudescence in 2-year(P<0.05).Multiple analysis showed that TS expression was independent prognostic factors for RC. Conclusion The expression of TS is a significant prognostic factors for RC,and can be regarded as a index for estimating the m alignant degree of RC and resistant 5-FU.
【Key words】 Rectal cancer;Thymidylate synthase;Immunohistochemistry
直肠癌是临床上常见的消化道肿瘤,由于隐蔽于肠道,早期难以发现,多数患者就诊时已经是中晚期病例,化疗是不可缺少的治疗手段之一,而肿瘤对化疗药物的耐药往往是肿瘤复发的重要原因之一。5-FU类药物是结肠直肠癌化疗的基本用药之一。胸苷酸合成酶( thymidylate synthase,TS)是5-FU作用的靶酶,TS的作用是催化脱氧尿嘧啶核苷酸转化为脱氧胸苷酸,它是DNA合成所必需的成分,其结果是破坏了细胞内DNA合成的核苷酸池,影响了DNA的合成,导致肿瘤细胞死亡。本研究目的在于通过检测耐药相关基因TS在直肠癌组织中的表达情况,探讨TS在直肠癌的表达的及否可以预测肿瘤耐药情况。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本院从2004年7月至2006年7月对48例直肠癌患者的病理标本切片进行TS免疫组化检查。全组男33例,女15例,年龄23～83岁,平均(50±3.2)岁。全组管状腺癌22例,乳头状腺癌13例,粘液腺癌(包括印戒细胞癌)13例。分DukesA期7例,期DukesB期21例,DukesC期20例。按照直肠癌部位:高位13例、中位21例、低位14例。分化程度:高分化20例,中分化17例,低分化11例。所有病例均行根治性手术及FOLFOX4方案初次化疗。具体临床病理资料详见附表1。
1.2 主要试剂和仪器 鼠抗人TS单克隆抗体、DAB 显色试剂盒,SP 试剂盒均为迈新公司产品。主要仪器有显微镜、切片机、烤箱、染色缸、湿盒。
1.3 实验方法 分别标本的正常部分肠管壁、癌旁组织和癌组织进行取材并固定,分别取肿瘤组织约2 cm×2 cm×0.5 cm 大小去除坏死组织,置于10%中性缓冲甲醛溶液固定24 h,常规石蜡包埋。常规石蜡切片做4μm 连续切片,展开后捞片,置烤箱中60℃烤片3 h。免疫组化染色采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。实验对照采用SP法,操作严格按照上述步骤要求进行,以PBS 缓冲代替一抗作为阴性对照。
1.4 TS表达的判断标准:以胞浆/胞核出现棕黄色颗粒为阳性,根据表达阳性细胞数的百分比判定TS蛋白表达高低,计算4个具有代表性的高倍视野中100个细胞中阳性细胞的百分数。-:<10%;+:10%～50%;++:>50%。判定阳性细胞数>50%为TS高表达,<50%为TS低表达。
1.5 统计学方法 采用SPSS 10.0软件分析。应用四格表的 χ2检验分析结直肠癌组织TS的表达和临床病理特征的相关性,用Kap lan-Merier法比较生存情况,并进行log-rank检验,多因素COX比例风险模型进行预后的多因素分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 TS在正常部分的肠管、癌旁组织和癌组织中的表达情况:TS在三部分组织中均有阳性表达,正常、癌旁和癌组织TS阳性表达率分别为:54.2%、72.9%和89.6%( χ2=14.858,P=0.001),其中高表达率分别为:16.7%、27.1%和47.9%( χ2=30.713,P=0.000)。提示:TS在上述三部分组织中的表达有显著性差异,且离癌组织越近高表达率越高(P<0.05),详见表1。
2.2 TS的表达与肿瘤分期的关系 TS在Dukes A、B、C三期的阳性表达率分别为:42.9%、66.7%和85%,其中高表达率分别为14.3%、38.1%和60%提示TS在早期表达率较低,在中晚期表达率较高(P<0.05),详见表1。
2.3 TS的表达与肿瘤组织学类型的关系 TS在管状腺癌、乳头状和粘液性腺癌中的阳性表达率和高表达率分别为:63.6%、61.5%、69.2%和31.8%、30.8%、38.5%,提示三种类型的TS表达率无显著性差异(P>0.05),详见表1。
2.4 TS的表达与组织分化程度的关系
TS在低分化、中分化和高分化中的阳性表达率和高表达率分别为:92.9%、76.2%、53.9%和64.3%、23.8%、15.8%,提示低分化中TS阳性表达率和高表达率均明显高于高分化中(P<0.05),详见附表1。
2.5 TS的表达与2年内肿瘤复发的关系本组病例2年内复发率为33.3%(16/48),TS在复发组和非复发组的阳性表达率和高表达率分别为:87.5%、46.9%(P=0.007)和56.3%、21.9%(P=0.017),提示复发组TS的表达率和高表达率明显高于未复发者(P<0.05),详见附表1。
表1
TS的表达与直肠癌的临床病理参数关系(例,%)
项目例数TS
-+++P值
正常部分肠壁组织4822(45.8)18(37.5)8(16.7)<0.05
癌旁组织4813(27.1)22(45.8)13(27.1)
癌组织485(10.4)20(41.7)23(47.9)
Dukes分期
A74(57.1)2(28.6)1(14.3)
B217(33.3)6(28.6)8(38.1)
C203(15)5(25)12(60)<0.05
病理类型:
管状腺癌228(36.4)7(31.8)7(31.8)
乳头状腺癌135 (38.5)4(30.8)4(30.8)
粘液性腺癌134(30.8)4(30.8)5(38.5)>0.05
分化程度:
低分化141(7.1)4(28.6)9(64.3)
中分化215(23.8)11(53.4)5(23.8)
高分化136(46.1)5(38.5)2(15.4)<0.05
2年内复发与否
是16(33.33)2(12.5)5(31.3)9(56.3)
否32(66.7)17(53.1)8(25)7(21.9)<0.05
2.6 TS表达及临床病理因素与直肠癌预后的分析 Kap lan-Meier单因素分析显示,Dukes分期、组织分化程度、TS表达率和预后具有相关性。DukesA期直肠癌的预后明显优于晚期直肠癌Dukes C期(P<0.01)。高分化腺癌预后优于低分化腺癌(P<0.01)。TS低表达者预后明显优于高表达者(P<0.05) 。
2.7 直肠癌预后的多因素COX比例风险模型分析 将年龄、性别、临床分期、组织学类型、组织分化程度和TS的表达一起引入风险回归模型进行预后的多因素分析,结果显示:临床分期、组织分化程度和TS的表达是影响预后的重要因素(见表2)。
表2
直肠癌症预后的多因素COX比例风险模型分析
因素回归系数标准误Wald检验值P值
相对危险度
年龄0.013 80.660 10.014 40.700 20.732 7
性别0.021 40.725 30.823 30.655 30.765 1
临床分期0.717 30.311 37.508 10.005 32.330 7
病理类型0.089 90.447 20.035 40.641 60.880 3
组织分化程度0.797 00.280 15.371 30.030 42.515 1
TS表达0.783 30.334 17.110 30.021 3
2.397 3
3 讨论
本研究显示:TS在癌组织中阳性表达率高于正常组织和癌旁组织;中晚期阳性表达率高于早期病例;低分中阳性表达率高于高分化组织;2年复发组中阳性表达率高于非复发组(P<0.05)。TS在癌组织高表达率47.9%和在2年内复发病例高表达率为56.3%提示TS的高表达率与肿瘤复发有着密切关系,可能与TS高表达率病例更容易出现对5-FU耐药有关。TS 5’-UTR 28bp 3R /3R基因型患者对5-FU的化疗有效率低于2R /2R、2R /3R基因型,其机制认为TS基因5’-UTR多态性影响了正常组织和肿瘤组织的TS mRNA表达[1] ,3R /3R基因型患者的TS mRNA表达明显高于2R /2R、2R /3R组[2],导致前者有较高的TS蛋白表达,高表达TS蛋白对FdUMP有较高的IC50(50%)抑制浓度)值,使FdUMP不能有效的抑制TS,影响肿瘤细胞DNA的合成[3],使5-FU治疗疗效差,肿瘤更容易复发。TS及DPD mRNA水平对应用5 - 氟脲嘧啶治疗胃肠癌的疗效具有一定预测价值,TS5’-UTR 3R /3R基因型的检测对于预测患者对5-FU为主的化疗疗效有参考价值,TS的表达状况是影响预后的参考指标[4-6]。本研究显示TS不仅与肿瘤恶性程度有关,而且是一个影响预后的重要因素。
参考文献
[1] Toriumi F,Kubota T,Saikawa Y,et al. Thymidylate synthetase (TS) genotype and S/dihydropyrimidinedehydrogenase mRNA level as an indicator in determining chemosensitivity to 5-fluorouracil in advanced gastric carcinoma. Anticancer Res,2004,24(4):2455-2463.
[2] Mandola MV,Stoehlmacher J,Zhang W,et al. A 6bp polymorphism in the thymidylate synthaes gene causes message instability and is associated with decreased intratumoral TS mRNA levels. Pharmacogenetics,2004,14(5):319-327.
[3] KanekoM,Kawakami K,Ovama K,et al. The association of expression and gene polymorphism of the thymidylate synthase gene with 5-fluoro-5’-deoxyuridine sensitivity in gastric cancer cell lines. Gan To Kaqaku Ryoho,2004,31 (9) : 1347-1350.
[4] 董秋美,何友兼,郑伟华,等.结直肠癌组织胸苷酸合成酶的表达及临床意义.肿瘤,2007,27(11):907-909.
[5] 赵晶,张景然,赵利红.TS、DPD表达水平对5-FU疗效的预测价值.放射免疫学杂志.2007,20(1):63-65
[6] 轩菡,顾康生,冯继峰,等.床肿瘤学杂志,2008,13(7):594-597.