【摘 要】
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目的构建针对Toll样受体(TLR)4 mRNA的小发夹结构RNA(shRNA)真核表达载体pEGFP-siRNA/TLR4,检测该shRNA诱导的RNA干扰(RNAi)对脂多糖刺激RAW264.7细胞分泌炎症因子的抑制作用
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目的构建针对Toll样受体(TLR)4 mRNA的小发夹结构RNA(shRNA)真核表达载体pEGFP-siRNA/TLR4,检测该shRNA诱导的RNA干扰(RNAi)对脂多糖刺激RAW264.7细胞分泌炎症因子的抑制作用,以探讨针对TLR4基因的RNAi对RAW264.7细胞炎症反应的抑制作用.方法构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及shRNA克隆位点的质粒pEGFP-H1/siRNA,运用网络工具siRNA Wizard(http://www.simawizard.com/)设计针对TLR4 mRNA的寡核苷酸片段.将其克隆入pEGFP-H1/siRNA,构建表达EGFP及TLR4-shRNA的真核表达质粒pEGFP-H1/TLR4-siRNA.运用脂质体转染技术将pEGFP-H1/TLR4-siRNA转染至培养的小鼠巨噬细胞系RAW264.7,观察细胞系中荧光蛋白的表达强度;再运用脂多糖刺激转染的RAW264.7细胞,运用ELISA方法检测该细胞系分泌炎症因子水平的变化.结果质粒pEGFP-H1/siRNA及pEGFP-H1/TLR4-siRNA分别用Bbs Ⅰ和MluⅠ酶切电泳后,前者出现4.9 kb和340 bp的的条带,后者出现5.0 kb和220 bp的条带,与实验设计的质粒长度一致,且测序证实克隆序列正确.将pEGFP-H1/TLR4-siRNA转染至RAW264.7细胞后,EGFP的表达率为50%±8%.用脂多糖刺激后,TLR4-SiRNA转染组细胞培养液TNF-α水平(2 h:825 pg/ml±136 pg/ml;8 h:2190 pg/ml±359 pg/ml)明显低于对照siRNA转染组(2 h:1179 pg/ml±240 pg/ml;8 h:4720 pg/ml±227 pg/ml,均P＜0.01).结论针对TLR4 mRNA的shRNA可能通过RNAi机制对脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症因子的分泌有明显的抑制作用.
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