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摘要：本文主要利用快速检测方法和传统检验结合，对测量审核样品进行检测，从本次实验可知传统方法与仪器以及快速生化鉴定法结合运用，相互补充可提高检测的准确性和效率。
关键词：沙门氏菌 杜邦BAX@Q7 PCR 生化鉴定 血清学鉴定
中图分类号：R155 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2013）24-0000-00
沙门氏菌是一种可以引起沙门氏菌病广泛分布在自然界的人畜共患的致病菌之一，是最常见的食源性致病菌，我国每年因沙门氏菌造成的食物中毒事件占全部食物中毒事件的40%～60%。沙门氏菌的血清型超过2000多种，且生化反应复杂，传统的方法全依靠人工检测，大大增加了检测难度。单纯依靠传统方法检测，需要投入大量的人力物力，且耗时长，难以满足目前形势，在此需求下，快速、简单、准确、特异性强的检测方法应运而生。
1 实验
1.1 试剂和样品
1.1.1 样品
样品来自辽宁出入境检验检疫局的测量审核冻干粉样品，编号为2012-MA-828。
1.1.2设备和试剂
冰箱、恒温培养箱、生化培养箱、生物显微镜、杜邦BAX@Q7：缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋琼脂（BS）、木糖醇赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂、HE琼脂、沙门氏菌显色培养基（环凯）、脑心浸出液肉汤（BHI）、三糖铁（TSI）琼脂、沙门氏菌生化鉴定试剂盒（环凯）、沙门氏菌诊断血清（宁波天润）：
1.2实验方法
1.2.1待测样品的制备
无菌开启西林瓶，立即加入少量稀释液进行溶解，稀释液合计40ml，先用少量稀释液溶解样品，待溶解后，吸出放入无菌瓶中，反复用余下稀释液清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入上述无菌瓶中，此液即是待测样品。
1.2.2沙门氏菌的检测
（1）传统方法检测 （国标法GB 4789.4-2010）。吸取待测样品25ml于225ml缓冲蛋白胨水（BPW）中，于36℃培养18～24h。取BPW增菌液1ml转接到10mlTTB增菌液中，于42℃培养18～24h。另取BPW增菌液1ml转接到10mlSC增菌液中，于36℃培养18～24h。从TTB增菌液中挑1环划线分别接种到BS琼脂平板和沙门氏显色培养基中，于36℃培养40～48h；从SC增菌液中挑1环划线分别接种到XLD琼脂平板、HE琼脂平板和沙门氏显色培养基中，于36℃培养18～24h。观察所有平板是否有可疑菌落。
（2）杜邦BAX@Q7方法检测。取按传统方法培养的BPW增菌液1ml到5mlBHI培养液中于36℃培养8～18h。另取传统方法培养的SC增菌液，同时用杜邦BAX@Q7检测。样品处理方法按照杜邦BAX@Q7检测沙门氏菌试剂盒说明进行，根据所需要进行的反应个数取适量的裂解液，按每ml裂解液中加入12.5μL蛋白酶比例添加蛋白酶试剂。充分混匀后，每管分装200μL裂解液至裂解管中。分别加5μLBHI培养物和SC培养物到对应的裂解管中，做好标记。将裂解管于37℃孵育20min后，再95℃裂解10min，最后在冷却模块上冷却5min。吸取处理好的样品液50μL至试剂盒配套的PCR管（含有PCR反应需要的所有试剂），上机反应，从上机运行开始到结束需3.5小时。
1.3沙门氏菌的确证和鉴定
1.3.1菌落形态观察
在BS琼脂平板上，菌落呈褐色至黑色，带金属光泽，菌落周围培养基有褐色的晕环；在XLD琼脂平板上，粉色菌落带黑色中心，有些菌落呈现全黑色；HE琼脂平板上，为带黑色中心的蓝色菌落；沙门氏菌显色培养基上，菌落呈品红色，扁平透明，边缘光滑，直径约2mm。挑取上述的可疑菌落进行革兰氏染色检验，观察菌落形态。
1.3.2沙门氏菌鉴定
（1）生化鉴定。先从选择性平板上分别挑取可疑菌落接种三糖铁（TSI）琼脂斜面，先底层穿刺，再斜面划线。培养TSI琼脂斜面时需保持需氧的环境，才能防止产生过量的硫化氢（H2S）使琼脂变全黑，因此TSI琼脂斜面的试管最好使用棉花塞。另挑取数个可疑菌落于0.85%灭菌生理盐水中，制成约0.5麦氏的菌悬液，将菌悬液分别接种于生化鉴定试剂管中，包括靛基质（蛋白胨水）、pH7.2尿素、赖氨酸脱羧酶、氰化钾（KCN）、甘露醇、山梨醇、β-半乳糖苷醇（ONPG），于36℃培养18～24h，必要时可延长培养时间至48h，观察结果。
（2）血清学鉴定。一般采用1.2～1.5%琼脂培养物做血清学鉴定，先挑取可疑菌落于营养琼脂中进行纯培养。沙门氏菌多价菌体抗原（O）血清鉴定，在玻片两头分别划出1cm×2cm区域，挑一环待测菌落，两边各放1/2环，一边滴一滴多价菌体抗原（O）血清，另一边滴加无菌生理盐水做对照。用无菌接种环将两边菌落研成乳状液，在黑暗背景下观察，任何程度凝集都是阳性反应。多价鞭毛抗原（H）血清鉴定操作跟多价菌体抗原（O）血清一样。
2 结果分析
生化鉴定的结果如下：靛基质（-）、尿素（-）、KCN（-）、赖氨酸脱羧酶（+）、山梨醇（+）、甘露醇（+）、ONPG（-）；注：“-”表示阴性，“+”表示阳性。本次血清学试验的疑是菌的多价菌体（O）抗原和多价鞭毛（H）抗原都出现了不同程度的凝集，同时生理盐水对照中没有出现凝集。结合生化鉴定和血清学鉴定的结果，可判定本次待测样品沙门氏菌阳性。
3 结语
国标法鉴定结果准确可靠是公认的，但因沙门氏菌血清型种类多，生化特异性大，使得检验程序更加复杂，检验过程需要反复的接种培养，一般都需要4～7天才能出结果。美国杜邦公司的BAX致病菌检测系统是利用PCR技术筛选样品中致病菌的检测系统之一，优点在于特异性强，假阳性低，耗时短，从增菌到检测48h内可出检验结果。本次实验用杜邦BAX@Q7的目的是先于传统方法检测出样品中是否有沙门氏菌，为后面传统方法的平板分离和生化鉴定做准备。在已知阳性可能性很高的情况下，适量增加分离平板数和提高划线质量，着重对可疑菌进行检测，有效提高检测效率。
参考文献
[1]GB 4789.4-2010.食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验.
[2]刘喆，张书萧，王少辉，陈晓平，等.沙门氏菌的检测技术进展.
[3]曾丽华.浅谈沙门氏菌的比对检验.
关键词：沙门氏菌 杜邦BAX@Q7 PCR 生化鉴定 血清学鉴定
中图分类号：R155 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2013）24-0000-00
沙门氏菌是一种可以引起沙门氏菌病广泛分布在自然界的人畜共患的致病菌之一，是最常见的食源性致病菌，我国每年因沙门氏菌造成的食物中毒事件占全部食物中毒事件的40%～60%。沙门氏菌的血清型超过2000多种，且生化反应复杂，传统的方法全依靠人工检测，大大增加了检测难度。单纯依靠传统方法检测，需要投入大量的人力物力，且耗时长，难以满足目前形势，在此需求下，快速、简单、准确、特异性强的检测方法应运而生。
1 实验
1.1 试剂和样品
1.1.1 样品
样品来自辽宁出入境检验检疫局的测量审核冻干粉样品，编号为2012-MA-828。
1.1.2设备和试剂
冰箱、恒温培养箱、生化培养箱、生物显微镜、杜邦BAX@Q7：缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋琼脂（BS）、木糖醇赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂、HE琼脂、沙门氏菌显色培养基（环凯）、脑心浸出液肉汤（BHI）、三糖铁（TSI）琼脂、沙门氏菌生化鉴定试剂盒（环凯）、沙门氏菌诊断血清（宁波天润）：
1.2实验方法
1.2.1待测样品的制备
无菌开启西林瓶，立即加入少量稀释液进行溶解，稀释液合计40ml，先用少量稀释液溶解样品，待溶解后，吸出放入无菌瓶中，反复用余下稀释液清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入上述无菌瓶中，此液即是待测样品。
1.2.2沙门氏菌的检测
（1）传统方法检测 （国标法GB 4789.4-2010）。吸取待测样品25ml于225ml缓冲蛋白胨水（BPW）中，于36℃培养18～24h。取BPW增菌液1ml转接到10mlTTB增菌液中，于42℃培养18～24h。另取BPW增菌液1ml转接到10mlSC增菌液中，于36℃培养18～24h。从TTB增菌液中挑1环划线分别接种到BS琼脂平板和沙门氏显色培养基中，于36℃培养40～48h；从SC增菌液中挑1环划线分别接种到XLD琼脂平板、HE琼脂平板和沙门氏显色培养基中，于36℃培养18～24h。观察所有平板是否有可疑菌落。
（2）杜邦BAX@Q7方法检测。取按传统方法培养的BPW增菌液1ml到5mlBHI培养液中于36℃培养8～18h。另取传统方法培养的SC增菌液，同时用杜邦BAX@Q7检测。样品处理方法按照杜邦BAX@Q7检测沙门氏菌试剂盒说明进行，根据所需要进行的反应个数取适量的裂解液，按每ml裂解液中加入12.5μL蛋白酶比例添加蛋白酶试剂。充分混匀后，每管分装200μL裂解液至裂解管中。分别加5μLBHI培养物和SC培养物到对应的裂解管中，做好标记。将裂解管于37℃孵育20min后，再95℃裂解10min，最后在冷却模块上冷却5min。吸取处理好的样品液50μL至试剂盒配套的PCR管（含有PCR反应需要的所有试剂），上机反应，从上机运行开始到结束需3.5小时。
1.3沙门氏菌的确证和鉴定
1.3.1菌落形态观察
在BS琼脂平板上，菌落呈褐色至黑色，带金属光泽，菌落周围培养基有褐色的晕环；在XLD琼脂平板上，粉色菌落带黑色中心，有些菌落呈现全黑色；HE琼脂平板上，为带黑色中心的蓝色菌落；沙门氏菌显色培养基上，菌落呈品红色，扁平透明，边缘光滑，直径约2mm。挑取上述的可疑菌落进行革兰氏染色检验，观察菌落形态。
1.3.2沙门氏菌鉴定
（1）生化鉴定。先从选择性平板上分别挑取可疑菌落接种三糖铁（TSI）琼脂斜面，先底层穿刺，再斜面划线。培养TSI琼脂斜面时需保持需氧的环境，才能防止产生过量的硫化氢（H2S）使琼脂变全黑，因此TSI琼脂斜面的试管最好使用棉花塞。另挑取数个可疑菌落于0.85%灭菌生理盐水中，制成约0.5麦氏的菌悬液，将菌悬液分别接种于生化鉴定试剂管中，包括靛基质（蛋白胨水）、pH7.2尿素、赖氨酸脱羧酶、氰化钾（KCN）、甘露醇、山梨醇、β-半乳糖苷醇（ONPG），于36℃培养18～24h，必要时可延长培养时间至48h，观察结果。
（2）血清学鉴定。一般采用1.2～1.5%琼脂培养物做血清学鉴定，先挑取可疑菌落于营养琼脂中进行纯培养。沙门氏菌多价菌体抗原（O）血清鉴定，在玻片两头分别划出1cm×2cm区域，挑一环待测菌落，两边各放1/2环，一边滴一滴多价菌体抗原（O）血清，另一边滴加无菌生理盐水做对照。用无菌接种环将两边菌落研成乳状液，在黑暗背景下观察，任何程度凝集都是阳性反应。多价鞭毛抗原（H）血清鉴定操作跟多价菌体抗原（O）血清一样。
2 结果分析
生化鉴定的结果如下：靛基质（-）、尿素（-）、KCN（-）、赖氨酸脱羧酶（+）、山梨醇（+）、甘露醇（+）、ONPG（-）；注：“-”表示阴性，“+”表示阳性。本次血清学试验的疑是菌的多价菌体（O）抗原和多价鞭毛（H）抗原都出现了不同程度的凝集，同时生理盐水对照中没有出现凝集。结合生化鉴定和血清学鉴定的结果，可判定本次待测样品沙门氏菌阳性。
3 结语
国标法鉴定结果准确可靠是公认的，但因沙门氏菌血清型种类多，生化特异性大，使得检验程序更加复杂，检验过程需要反复的接种培养，一般都需要4～7天才能出结果。美国杜邦公司的BAX致病菌检测系统是利用PCR技术筛选样品中致病菌的检测系统之一，优点在于特异性强，假阳性低，耗时短，从增菌到检测48h内可出检验结果。本次实验用杜邦BAX@Q7的目的是先于传统方法检测出样品中是否有沙门氏菌，为后面传统方法的平板分离和生化鉴定做准备。在已知阳性可能性很高的情况下，适量增加分离平板数和提高划线质量，着重对可疑菌进行检测，有效提高检测效率。
参考文献
[1]GB 4789.4-2010.食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验.
[2]刘喆，张书萧，王少辉，陈晓平，等.沙门氏菌的检测技术进展.
[3]曾丽华.浅谈沙门氏菌的比对检验.