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摘 要 HOG MAPK途径在植物病原真菌生长发育、致病过程和对杀菌剂敏感性等方面发挥重要功能，但在不同的病原真菌中具有一定差异。为研究Hog1蛋白在橡胶树炭疽菌（Colletotrichum siamense）中的功能和调控机制，本研究利用同源克隆法克隆获得橡胶树炭疽菌（C. siamense）的CsHog1基因，构建GST-CsHog1融合表达载体，利用SDS-PAGE和Western Blot检测蛋白表达情况。结果表明：橡胶树炭疽菌（C. siamense）的CsHog1基因大小1383 nt，编码459个氨基酸，包含5个内含子，具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域;聚类分析显示橡胶树炭疽菌的CsHog1基因编码的氨基酸序列与黄瓜炭疽菌的ClOsc1（Hog1同源基因）同源性最高。所构建的蛋白融合表达载体在供试条件下（IPTG 0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L;温度16、25、28 ℃）均可较好诱导表达，GST-CsHog1融合蛋白大小约为70 ku。用GST亲和层析柱纯化获得蛋白，经Western Blot检测显示该蛋白可与GST单克隆抗體特异性结合。
关键词 橡胶树;橡胶树炭疽菌;Hog1基因;蛋白纯化;原核表达
中图分类号 S794.1 文献标识码 A
Abstract The high osmolarity glycerol （HOG） response pathway plays important roles in growth and development， pathogenesis， fungicide sensitivity etc. in phytopathogenic fungi， but its function may vary in different pathogenic fungi. In this study， sHog1 was cloned by homologous cloning from Colletotrichum siamense isolated from rubber trees in order to understand the role and regulatory mechanisms of Hog1 protein. GST-Hog1 fusion protein expression vectors were also constructed and expressed in Escherichia coli BL21 （DE3）. The expressed fusion proteins were analyzed on SDS-PAGE and Western Blotting. The results showed that CsHog1 contained 5 introns and encoded 459 amino acids and had the Serine / Threonine protein kinases catalytic domain S_TKc. Phylogenetic clustering showed that CsHog1 shared the highest similarity to ClOsc1 （Hog1 homologue） of C. lagenarium. SDS-PAGE analysis showed that GST-Hog1 protein was successfully expressed in E. coli under the induction of IPTG at 0.3， 0.5， 0.8 and 1.0 mmol/L and at incubation temperature of 16， 25 or 28 ℃. The size of the fusion proteins was 70 ku which was identical to the expected molecular weight. Western Blotting showed that the purified fusion protein could be recognized by GST antibodies.
Keywords rubber tree; Colletotrichum siamense; Hog1 gene; protein purification; prokaryotic expression
DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.014
HOG MAPK途径（High Osmohrity Glycerol Mitogen-activated Protein Kinase Signaling Transduction Pathway）是生物体MAPK途径中参与渗透压响应的重要通路，在植物病原真菌中还可能参与病菌致病过程、营养生长、杀菌剂敏感性、有性和无性生殖以及氧化、细胞壁修饰和其他应激反应等。现有研究表明，除了参与渗透调节功能外，HOG MAPK途径在不同植物病原真菌中的功能具有物种特异性，在西瓜炭疽菌（Colletotrichum orbiculare）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、稻胡麻斑病菌（Bipolaris oryzae）中与病原菌致病能力无明显相关性，而在禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、旋孢腔菌（Cochliobolus sativus）等病原真菌中则参与致病;在大丽轮枝菌（Verticillium dabliae）、灰葡萄孢菌（B. cinerea）、西瓜炭疽菌（C. orbiculare）、黄瓜炭疽菌（C. lagenarium）、异旋孢腔菌（Cochliobolus heterostrophus）中参与调控病原菌对咯菌腈等吡咯类杀菌剂的敏感性;在禾谷镰孢菌（F. graminearum）、稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）、旋孢腔菌（C. sativus）中参与菌丝生长，而在西瓜炭疽菌（C. orbiculare）、稻瘟病菌（M. oryzae）、灰葡萄孢菌（B. cinerea）等真菌中则不参与[1-8]。 橡胶是我国四大战略物资之一，对我国的经济及国防建设具有重大意义。橡胶树炭疽病是橡胶树的一种重要叶部病害[9]。其病原菌主要有胶孢炭疽菌复合群（C. gloeosporioides species complex）和尖孢炭疽菌复合群（C. acutatun species complex），其中C. siamense胶孢炭疽菌复合群为主要类群[10-11]。实验室前期研究显示橡胶树炭疽菌HOG MAPK途径与病原菌对杀菌剂咯菌腈（fludioxioil）的抗性相关[12]。但炭疽菌是如何通过HOG1 MAPK信号途径调控对咯菌腈的抗性，其上下游调控基因及作用机制等仍是未知的。本研究采用同源法克隆获得我国海南橡胶树炭疽菌优势种群C. siamense Hog1同源基因，并构建了该基因的原核表达载体，在大肠杆菌中成功表达获得GST-CsHog1融合蛋白及其纯化蛋白，为进一步以Hog1蛋白为诱饵钓取其互作蛋白，深入研究HOG1 MAPK信号途径在炭疽菌对咯菌腈抗性调控机理的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及质粒 橡胶树炭疽菌C. siamense HN08分离自海南琼中新进农场橡胶树病叶，由本实验室分离鉴定保存[10];大肠杆菌Escherichia coli DH5a和载体PMD-18T购自大连TaKaRa公司;工程菌BL21（DE3）和表达载体pGST由海南大学陶均老师惠赠。
1.1.2 试剂 高保真DNA聚合酶、蛋白质Marker、DNA Marker、RNA反转录试剂盒One-step gDNA Removal和cDNA Synthesis SuperMix均购自北京全式金生物技术有限公司;限制性内切酶（BamHⅠ和HindⅢ）购自宝生物工程（大连）有限公司;凝胶DNA小量回收试剂盒购自广州美基生物科技有限公司;质粒提取试剂盒购自美国Omega Bio-Tek公司;GST标签蛋白纯化试剂盒、PMSF（苯甲基磺酰氟）购自上海碧云天生物技术有限公司;GST单克隆抗体购自proteintech公司;荧光二抗购自Abcam公司;T4 DNA连接酶，IPTG购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒，Tween-20购自北京索莱宝科技有限公司;考马斯亮蓝染色液和脱色液购自广州赛国生物科技有限公司;RNA prep Pure试剂盒与2×Taq PCR Master mix购自TIANGEN公司;10×PBS、4×蛋白质上样缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司;10×RealBlot快速转膜液购自广州赛国生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基 LB培养基配方及制备方法参照王茜[13]的方法进行。
1.2 方法
1.2.1 橡胶树炭疽菌C. siamense CsHog1基因的克隆和分析 参照RNAprep Pure试剂盒说明书操作步骤提取总RNA，按照反转录试剂盒步骤反转录合成cDNA。在NCBI数据库搜索获得炭疽菌Hog1基因序列（BAD11137.1），利用本地BLAST法在橡胶树炭疽菌（C. siamense）HN08转录组序列数据库（本实验室保存）中比对获得同源序列，设计引物对CS-HOG1-OF（5′-CGCGG ATCCGCGGAATTCATCAGAGCACA-3′）和CS- HOG1-OR（5′-CCCAAGCTTCTATTGCCCGTTGAATTGCTGCTCC-3′），分别以橡胶树炭疽菌C. siamense HN08的DNA和cDNA为模板进行扩增，反应体系为：DNA/cDNA模板1 μL，上下游引物1 μL，2×Taq PCR Master mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，总反应体积25 μL。反应条件为：95 ℃，5 min;95 ℃，30 s;58 ℃，30 s;72 ℃，60 s;35个循环后，72 ℃，10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。并将PCR产物回收连接载体PMD-18T获得重组质粒，连接产物转化感受态细胞DH5a，经过PCR验证正确，取阳性转化子，送往深圳华大基因研究院测序。重复3次。
比较分析DNA和cDNA序列，了解外显子和内含子，并与GenBank中同源序列进行分析，参考基因序列信息见表1，利用NCBI网站上的BLASTx软件完成。cDNA序列翻译成氨基酸序列，利用在线的简单模块构架搜索工具（Simple modular architecture research tool， SMART; http：//smart.embl-heidelberg. de/smart/set_mode.cgi）对氨基酸序列进行结构功能域分析;用网站（http：//web.expasy. org/protparam/）预测融合蛋白分子量。
1.2.2 橡胶树炭疽菌C. siamense CsHog1基因表达载体的构建 以cDNA为模板克隆获得的质粒命名为pMD-CsHog1，用限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ酶切质粒pMD-CsHog1和原核表达载体pGST，利用T4 DNA连接酶将CsHog1片段连接到pGST表达载体上，转化大肠杆菌感受态细胞E. coli DH5a，涂布于含有50 ?g/L卡那霉素的LB平板，37 ℃培养过夜，挑取若干单克隆菌落菌液PCR验证阳性克隆。测序正确后摇菌提质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3），质粒命名为GST-CsHog1。
1.2.3 GST-CsHog1融合蛋白的誘导表达 挑取GST-CsHog1单菌落和pGST单菌落（对照）接种于含50 ?g/L氨苄的5 mL LB培养基的试管中，在37 ℃摇菌培养过夜，吸取1 mL菌液转移至含氨苄的100 mL LB培养基锥形瓶中，37 ℃摇菌培养至OD600值0.6～0.8，再向锥形瓶中加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，在28 ℃摇床诱导6 h试表达，以空载体为对照。收集菌体重悬于4 ℃预冷的PBS中，加入终浓度0.5 mmol/L蛋白酶抑制剂?使用超声破碎仪破碎菌体至菌液澄清，将破碎澄清的菌体离心15 min后，分别取上清和沉淀各30 μL分别进行SDS-PAGE检测。GST-CsHog1融合蛋白试表达后，对IPTG浓度诱导条件进行选择，分别在菌液中加入终浓度为0、0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L的IPTG诱导剂，置于28 ℃，6 h培养，按上述方法进行SDS-PAGE检测。对温度诱导条件进行选择，在菌液中加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导剂，分别置于16、25、28、37 ℃，培养6 h，按上述方法进行SDS-PAGE检测。 1.2.4 免疫印迹试验Western blot 制作浓度为12%的SDS-PAGE蛋白胶，操作过程中尽量避免气泡的产生。将提取的蛋白上清上样。跑SDS-PAGE蛋白胶，电泳恒压80V。 在SDS-PAGE 进行电泳结束前十分钟，将4张小滤纸与膜剪好，将4张小滤纸、海绵、夹子一起提前浸泡于装有1×transter buffer 的铁盘中待用。将膜侵泡在甲醛中15 s后将膜转移到装有转膜缓冲液的铁盘里，膜反复侵泡至膜上水不聚成滴。待SDS-PAGE蛋白胶跑好后，将胶取出并侵泡在预冷的装有转膜缓冲液的铁盘中。将膜和胶放置好后，电压120 V，电流300 mA，转膜0.5 h。膜转好后在4 ℃的条件下用含有5%脱脂奶粉的PBST封闭膜8～10 h。然后加入GST抗体，GST抗体和5%脱脂奶粉的PBST的比例为1∶5000，4 ℃孵育8～10 h。用PBST洗膜3次，每次15 min。 在含有5%脱脂奶粉的PBST中加入荧光二抗，荧光二抗和5%脱脂奶粉的PBST的比例为1∶5000，室温孵育45 min。 用PBST洗膜3次，每次15 min。扫膜拍照。
1.2.5 蛋白纯化 利用碧云天公司提供的GST标签蛋白纯化试剂盒进行纯化。取1 mL混合均匀的BeyoGold GST-tag Purification Resin，4 ℃，1000 r/min离心30 s， 弃去储存液，向凝胶中加入0.5 mL裂解缓冲液重悬并平衡凝胶，4 ℃，1000 r/min离心30 s，弃去液体重复平衡一次，将蛋白上清加入其中，4 ℃在水平摇床上缓慢摇动1 h，将上清和凝胶的混和物装入亲和层析柱管中，将纯化柱底部盖子打开，使柱中液体流出，收集30 ?L流出液作后续分析用，洗柱5次，每次加入0.5 mL裂解缓冲液，每次收集30 ?L洗涤液作后续分析用，加入0.5 mL洗脱缓冲液，重悬凝胶，流出洗脱液。重复5～6次。纯化结果进行SDS-PAGE检测。
2 结果与分析
2.1 橡胶树炭疽菌C. siamense CsHog1基因的克隆和序列分析
橡胶树炭疽菌C. siamense CsHog1基因的PCR扩增电泳结果。将扩增获得序列进行测序分析，结果显示，所得基因序列包含完整的开放阅读框架数据，克隆获得CsHog1基因的DNA序列大小为1383 nt（登录号：MG88 7856），获得cDNA序列大小为1080 nt（GenBank登录号：MG887857），该基因含有5个内含子，编码459个氨基酸。利用在线蛋白质结构域预测软件分析，该蛋白含有S_TKc结构域，该结构域为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域。
将CsHog1氨基酸序列与GenBank中已有炭疽菌及其他真菌的同源蛋白进行序列比对，结果表明，橡胶树炭疽菌（C. siamense）CsHog1与稻瘟病菌（M. oryzae）、层生镰刀菌（F. proliferatum）、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）和黃瓜炭疽菌（C. lagenaria）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）的Hog1蛋白高度同源（95%以上），聚类分析显示其与黄瓜炭疽菌的ClOsc1聚为一类。
2.2 GST-CsHog1融合蛋白表达载体的构建、表达和纯化
分别挑取含融合表达质粒GST-CsHog1和对照质粒pGST的单菌落，按照上述方法诱导表达，提取粗蛋白进行SDS-PAGE检测显示，在70 ku左右处有一条明显条带，与预期蛋白大小相符，说明融合蛋白GST-CsHog1在大肠杆菌BL21中成功表达，融合蛋白在上清和包涵体中均有存在。不同IPTG浓度对GST-CsHog1融合蛋白表达的影响，在0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L的IPTG浓度下，GST-CsHog1融合蛋白均可较好诱导表达，无显著差异。不同温度诱导GST-CsHog1融合蛋白表达的结果，结果显示，在16、25、28 ℃诱导条件下融合蛋白表达量较好。
将表达的含CsHog1蛋白的上清液用GST亲和层析柱纯化。可获得与融合蛋白分子量一致的目的条带。GST蛋白的成功纯化。
2.3 融合蛋白GST-CsHog1的Western blot验证
为了证实表达的蛋白是GST-CsHog1，使用GST单克隆抗体，荧光抗体进行Western blot，结果显示融合蛋白GST-CsHog1可以和GST标签单克隆抗体结合，得到的目的条带的大小与融合蛋白GST-CsHog1分子量一致，该结果进一步说明GST-CsHog1融合蛋白在大肠杆菌BL21中成功表达。
3 讨论
本研究通过同源克隆法获得橡胶树炭疽菌C. siamense的CsHog1基因，该基因编码的氨基酸序列与稻瘟病菌（M. oryzae）、层生镰刀菌（F. proliferatum）、球孢白僵菌（B. bassiana）等真菌的Hog1蛋白一样都含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域，且与它们同源性极高，其中与黄瓜炭疽菌（C. lagenaria）ClOsc1同源性最高，推测该蛋白与黄瓜炭疽菌ClOsc1功能相似。本研究构建了GST-CsHog1融合蛋白表达载体，并进行了原核表达。根据前人报道，诱导温度和IPTG浓度可能影响菌体的生长和融合蛋白的表达。本研究设置了不同诱导温度和不同IPTG浓度，结果显示在供试条件中，上清液和包涵体中均存在GST-CsHog1融合蛋白，但16、25、28 ℃诱导条件下融合蛋白在上清中的表达量比37 ℃高，在0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L的IPTG浓度下，GST- CsHog1融合蛋白的表达并没有显著差异。在本研究中，虽然包涵体中融合蛋白含量较多，但在上清中能清晰看到融合蛋白的条带，并通过Western blot验证确认该条带为目的蛋白。为获得较多的可溶性蛋白，本研究纯化时加大了诱导菌体的量，用GST亲和层析柱纯化得到与融合蛋白GST-Hog1分子量一致的目的条带。但得到的纯化蛋白中有与GST大小一致的条带，分析原因可能是纯化过程中GST-Hog1融合蛋白断裂导致，另外在融合蛋白GST-Hog1的下方也有一个条带，分析原因可能是纯化过程中GST-Hog1融合蛋白断裂后的Hog1蛋白。GST-Hog1融合表达载体的成功构建及GST-Hog1融合蛋白的获得，为后续钓取CsHog1蛋白互作蛋白，深入研究HOG1 MAPK在炭疽菌的功能奠定了基础。 HOG MAPK途径在生物体中与杀菌剂、盐胁迫、生长等密切相关。Hog1作为该途径的关键基因，其所编码的蛋白与其他的蛋白互作共同发挥作用。例如：在芽殖酵母中Hog1p是第一个直接调节Aft1p的激酶，Hog1p-Aft1p相互作用若减少会导致Aft1p去磷酸化从而影响铁的稳态[14]。在白色念珠菌中细胞壁糖苷酶DFG5和DCW1是Hog1磷酸化所必需的[15]。在球孢白僵菌中Bbakr1是Hog1 MAPK通路的下游靶基因，它编码阿尔多酮还原酶，参与调控渗透和盐胁迫，与Bbhog 1关系密切[16]。尽管在多种真菌中HOG MAPK途径已经被较好的研究，但是该信号途径上下游网络并不十分清楚。炭疽菌HOG MAPK信号途经与咯菌腈等吡咯类杀菌剂及盐胁迫等方面也密切相关[17]，但炭疽菌是如何通过HOG信号途径调控对杀菌剂的抗性，其中有哪些关键调控基因，它们的作用机制如何仍是未知。本研究成功获得HOG MAPK途径重要成员CsHog1蛋白，为钓取与CsHog1蛋白互作的蛋白以及丰富HOG MAPK 信号网络成员奠定基础。
参考文献
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关键词 橡胶树;橡胶树炭疽菌;Hog1基因;蛋白纯化;原核表达
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Abstract The high osmolarity glycerol （HOG） response pathway plays important roles in growth and development， pathogenesis， fungicide sensitivity etc. in phytopathogenic fungi， but its function may vary in different pathogenic fungi. In this study， sHog1 was cloned by homologous cloning from Colletotrichum siamense isolated from rubber trees in order to understand the role and regulatory mechanisms of Hog1 protein. GST-Hog1 fusion protein expression vectors were also constructed and expressed in Escherichia coli BL21 （DE3）. The expressed fusion proteins were analyzed on SDS-PAGE and Western Blotting. The results showed that CsHog1 contained 5 introns and encoded 459 amino acids and had the Serine / Threonine protein kinases catalytic domain S_TKc. Phylogenetic clustering showed that CsHog1 shared the highest similarity to ClOsc1 （Hog1 homologue） of C. lagenarium. SDS-PAGE analysis showed that GST-Hog1 protein was successfully expressed in E. coli under the induction of IPTG at 0.3， 0.5， 0.8 and 1.0 mmol/L and at incubation temperature of 16， 25 or 28 ℃. The size of the fusion proteins was 70 ku which was identical to the expected molecular weight. Western Blotting showed that the purified fusion protein could be recognized by GST antibodies.
Keywords rubber tree; Colletotrichum siamense; Hog1 gene; protein purification; prokaryotic expression
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HOG MAPK途径（High Osmohrity Glycerol Mitogen-activated Protein Kinase Signaling Transduction Pathway）是生物体MAPK途径中参与渗透压响应的重要通路，在植物病原真菌中还可能参与病菌致病过程、营养生长、杀菌剂敏感性、有性和无性生殖以及氧化、细胞壁修饰和其他应激反应等。现有研究表明，除了参与渗透调节功能外，HOG MAPK途径在不同植物病原真菌中的功能具有物种特异性，在西瓜炭疽菌（Colletotrichum orbiculare）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、稻胡麻斑病菌（Bipolaris oryzae）中与病原菌致病能力无明显相关性，而在禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、旋孢腔菌（Cochliobolus sativus）等病原真菌中则参与致病;在大丽轮枝菌（Verticillium dabliae）、灰葡萄孢菌（B. cinerea）、西瓜炭疽菌（C. orbiculare）、黄瓜炭疽菌（C. lagenarium）、异旋孢腔菌（Cochliobolus heterostrophus）中参与调控病原菌对咯菌腈等吡咯类杀菌剂的敏感性;在禾谷镰孢菌（F. graminearum）、稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）、旋孢腔菌（C. sativus）中参与菌丝生长，而在西瓜炭疽菌（C. orbiculare）、稻瘟病菌（M. oryzae）、灰葡萄孢菌（B. cinerea）等真菌中则不参与[1-8]。 橡胶是我国四大战略物资之一，对我国的经济及国防建设具有重大意义。橡胶树炭疽病是橡胶树的一种重要叶部病害[9]。其病原菌主要有胶孢炭疽菌复合群（C. gloeosporioides species complex）和尖孢炭疽菌复合群（C. acutatun species complex），其中C. siamense胶孢炭疽菌复合群为主要类群[10-11]。实验室前期研究显示橡胶树炭疽菌HOG MAPK途径与病原菌对杀菌剂咯菌腈（fludioxioil）的抗性相关[12]。但炭疽菌是如何通过HOG1 MAPK信号途径调控对咯菌腈的抗性，其上下游调控基因及作用机制等仍是未知的。本研究采用同源法克隆获得我国海南橡胶树炭疽菌优势种群C. siamense Hog1同源基因，并构建了该基因的原核表达载体，在大肠杆菌中成功表达获得GST-CsHog1融合蛋白及其纯化蛋白，为进一步以Hog1蛋白为诱饵钓取其互作蛋白，深入研究HOG1 MAPK信号途径在炭疽菌对咯菌腈抗性调控机理的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及质粒 橡胶树炭疽菌C. siamense HN08分离自海南琼中新进农场橡胶树病叶，由本实验室分离鉴定保存[10];大肠杆菌Escherichia coli DH5a和载体PMD-18T购自大连TaKaRa公司;工程菌BL21（DE3）和表达载体pGST由海南大学陶均老师惠赠。
1.1.2 试剂 高保真DNA聚合酶、蛋白质Marker、DNA Marker、RNA反转录试剂盒One-step gDNA Removal和cDNA Synthesis SuperMix均购自北京全式金生物技术有限公司;限制性内切酶（BamHⅠ和HindⅢ）购自宝生物工程（大连）有限公司;凝胶DNA小量回收试剂盒购自广州美基生物科技有限公司;质粒提取试剂盒购自美国Omega Bio-Tek公司;GST标签蛋白纯化试剂盒、PMSF（苯甲基磺酰氟）购自上海碧云天生物技术有限公司;GST单克隆抗体购自proteintech公司;荧光二抗购自Abcam公司;T4 DNA连接酶，IPTG购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒，Tween-20购自北京索莱宝科技有限公司;考马斯亮蓝染色液和脱色液购自广州赛国生物科技有限公司;RNA prep Pure试剂盒与2×Taq PCR Master mix购自TIANGEN公司;10×PBS、4×蛋白质上样缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司;10×RealBlot快速转膜液购自广州赛国生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基 LB培养基配方及制备方法参照王茜[13]的方法进行。
1.2 方法
1.2.1 橡胶树炭疽菌C. siamense CsHog1基因的克隆和分析 参照RNAprep Pure试剂盒说明书操作步骤提取总RNA，按照反转录试剂盒步骤反转录合成cDNA。在NCBI数据库搜索获得炭疽菌Hog1基因序列（BAD11137.1），利用本地BLAST法在橡胶树炭疽菌（C. siamense）HN08转录组序列数据库（本实验室保存）中比对获得同源序列，设计引物对CS-HOG1-OF（5′-CGCGG ATCCGCGGAATTCATCAGAGCACA-3′）和CS- HOG1-OR（5′-CCCAAGCTTCTATTGCCCGTTGAATTGCTGCTCC-3′），分别以橡胶树炭疽菌C. siamense HN08的DNA和cDNA为模板进行扩增，反应体系为：DNA/cDNA模板1 μL，上下游引物1 μL，2×Taq PCR Master mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，总反应体积25 μL。反应条件为：95 ℃，5 min;95 ℃，30 s;58 ℃，30 s;72 ℃，60 s;35个循环后，72 ℃，10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。并将PCR产物回收连接载体PMD-18T获得重组质粒，连接产物转化感受态细胞DH5a，经过PCR验证正确，取阳性转化子，送往深圳华大基因研究院测序。重复3次。
比较分析DNA和cDNA序列，了解外显子和内含子，并与GenBank中同源序列进行分析，参考基因序列信息见表1，利用NCBI网站上的BLASTx软件完成。cDNA序列翻译成氨基酸序列，利用在线的简单模块构架搜索工具（Simple modular architecture research tool， SMART; http：//smart.embl-heidelberg. de/smart/set_mode.cgi）对氨基酸序列进行结构功能域分析;用网站（http：//web.expasy. org/protparam/）预测融合蛋白分子量。
1.2.2 橡胶树炭疽菌C. siamense CsHog1基因表达载体的构建 以cDNA为模板克隆获得的质粒命名为pMD-CsHog1，用限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ酶切质粒pMD-CsHog1和原核表达载体pGST，利用T4 DNA连接酶将CsHog1片段连接到pGST表达载体上，转化大肠杆菌感受态细胞E. coli DH5a，涂布于含有50 ?g/L卡那霉素的LB平板，37 ℃培养过夜，挑取若干单克隆菌落菌液PCR验证阳性克隆。测序正确后摇菌提质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3），质粒命名为GST-CsHog1。
1.2.3 GST-CsHog1融合蛋白的誘导表达 挑取GST-CsHog1单菌落和pGST单菌落（对照）接种于含50 ?g/L氨苄的5 mL LB培养基的试管中，在37 ℃摇菌培养过夜，吸取1 mL菌液转移至含氨苄的100 mL LB培养基锥形瓶中，37 ℃摇菌培养至OD600值0.6～0.8，再向锥形瓶中加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，在28 ℃摇床诱导6 h试表达，以空载体为对照。收集菌体重悬于4 ℃预冷的PBS中，加入终浓度0.5 mmol/L蛋白酶抑制剂?使用超声破碎仪破碎菌体至菌液澄清，将破碎澄清的菌体离心15 min后，分别取上清和沉淀各30 μL分别进行SDS-PAGE检测。GST-CsHog1融合蛋白试表达后，对IPTG浓度诱导条件进行选择，分别在菌液中加入终浓度为0、0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L的IPTG诱导剂，置于28 ℃，6 h培养，按上述方法进行SDS-PAGE检测。对温度诱导条件进行选择，在菌液中加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导剂，分别置于16、25、28、37 ℃，培养6 h，按上述方法进行SDS-PAGE检测。 1.2.4 免疫印迹试验Western blot 制作浓度为12%的SDS-PAGE蛋白胶，操作过程中尽量避免气泡的产生。将提取的蛋白上清上样。跑SDS-PAGE蛋白胶，电泳恒压80V。 在SDS-PAGE 进行电泳结束前十分钟，将4张小滤纸与膜剪好，将4张小滤纸、海绵、夹子一起提前浸泡于装有1×transter buffer 的铁盘中待用。将膜侵泡在甲醛中15 s后将膜转移到装有转膜缓冲液的铁盘里，膜反复侵泡至膜上水不聚成滴。待SDS-PAGE蛋白胶跑好后，将胶取出并侵泡在预冷的装有转膜缓冲液的铁盘中。将膜和胶放置好后，电压120 V，电流300 mA，转膜0.5 h。膜转好后在4 ℃的条件下用含有5%脱脂奶粉的PBST封闭膜8～10 h。然后加入GST抗体，GST抗体和5%脱脂奶粉的PBST的比例为1∶5000，4 ℃孵育8～10 h。用PBST洗膜3次，每次15 min。 在含有5%脱脂奶粉的PBST中加入荧光二抗，荧光二抗和5%脱脂奶粉的PBST的比例为1∶5000，室温孵育45 min。 用PBST洗膜3次，每次15 min。扫膜拍照。
1.2.5 蛋白纯化 利用碧云天公司提供的GST标签蛋白纯化试剂盒进行纯化。取1 mL混合均匀的BeyoGold GST-tag Purification Resin，4 ℃，1000 r/min离心30 s， 弃去储存液，向凝胶中加入0.5 mL裂解缓冲液重悬并平衡凝胶，4 ℃，1000 r/min离心30 s，弃去液体重复平衡一次，将蛋白上清加入其中，4 ℃在水平摇床上缓慢摇动1 h，将上清和凝胶的混和物装入亲和层析柱管中，将纯化柱底部盖子打开，使柱中液体流出，收集30 ?L流出液作后续分析用，洗柱5次，每次加入0.5 mL裂解缓冲液，每次收集30 ?L洗涤液作后续分析用，加入0.5 mL洗脱缓冲液，重悬凝胶，流出洗脱液。重复5～6次。纯化结果进行SDS-PAGE检测。
2 结果与分析
2.1 橡胶树炭疽菌C. siamense CsHog1基因的克隆和序列分析
橡胶树炭疽菌C. siamense CsHog1基因的PCR扩增电泳结果。将扩增获得序列进行测序分析，结果显示，所得基因序列包含完整的开放阅读框架数据，克隆获得CsHog1基因的DNA序列大小为1383 nt（登录号：MG88 7856），获得cDNA序列大小为1080 nt（GenBank登录号：MG887857），该基因含有5个内含子，编码459个氨基酸。利用在线蛋白质结构域预测软件分析，该蛋白含有S_TKc结构域，该结构域为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域。
将CsHog1氨基酸序列与GenBank中已有炭疽菌及其他真菌的同源蛋白进行序列比对，结果表明，橡胶树炭疽菌（C. siamense）CsHog1与稻瘟病菌（M. oryzae）、层生镰刀菌（F. proliferatum）、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）和黃瓜炭疽菌（C. lagenaria）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）的Hog1蛋白高度同源（95%以上），聚类分析显示其与黄瓜炭疽菌的ClOsc1聚为一类。
2.2 GST-CsHog1融合蛋白表达载体的构建、表达和纯化
分别挑取含融合表达质粒GST-CsHog1和对照质粒pGST的单菌落，按照上述方法诱导表达，提取粗蛋白进行SDS-PAGE检测显示，在70 ku左右处有一条明显条带，与预期蛋白大小相符，说明融合蛋白GST-CsHog1在大肠杆菌BL21中成功表达，融合蛋白在上清和包涵体中均有存在。不同IPTG浓度对GST-CsHog1融合蛋白表达的影响，在0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L的IPTG浓度下，GST-CsHog1融合蛋白均可较好诱导表达，无显著差异。不同温度诱导GST-CsHog1融合蛋白表达的结果，结果显示，在16、25、28 ℃诱导条件下融合蛋白表达量较好。
将表达的含CsHog1蛋白的上清液用GST亲和层析柱纯化。可获得与融合蛋白分子量一致的目的条带。GST蛋白的成功纯化。
2.3 融合蛋白GST-CsHog1的Western blot验证
为了证实表达的蛋白是GST-CsHog1，使用GST单克隆抗体，荧光抗体进行Western blot，结果显示融合蛋白GST-CsHog1可以和GST标签单克隆抗体结合，得到的目的条带的大小与融合蛋白GST-CsHog1分子量一致，该结果进一步说明GST-CsHog1融合蛋白在大肠杆菌BL21中成功表达。
3 讨论
本研究通过同源克隆法获得橡胶树炭疽菌C. siamense的CsHog1基因，该基因编码的氨基酸序列与稻瘟病菌（M. oryzae）、层生镰刀菌（F. proliferatum）、球孢白僵菌（B. bassiana）等真菌的Hog1蛋白一样都含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域，且与它们同源性极高，其中与黄瓜炭疽菌（C. lagenaria）ClOsc1同源性最高，推测该蛋白与黄瓜炭疽菌ClOsc1功能相似。本研究构建了GST-CsHog1融合蛋白表达载体，并进行了原核表达。根据前人报道，诱导温度和IPTG浓度可能影响菌体的生长和融合蛋白的表达。本研究设置了不同诱导温度和不同IPTG浓度，结果显示在供试条件中，上清液和包涵体中均存在GST-CsHog1融合蛋白，但16、25、28 ℃诱导条件下融合蛋白在上清中的表达量比37 ℃高，在0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L的IPTG浓度下，GST- CsHog1融合蛋白的表达并没有显著差异。在本研究中，虽然包涵体中融合蛋白含量较多，但在上清中能清晰看到融合蛋白的条带，并通过Western blot验证确认该条带为目的蛋白。为获得较多的可溶性蛋白，本研究纯化时加大了诱导菌体的量，用GST亲和层析柱纯化得到与融合蛋白GST-Hog1分子量一致的目的条带。但得到的纯化蛋白中有与GST大小一致的条带，分析原因可能是纯化过程中GST-Hog1融合蛋白断裂导致，另外在融合蛋白GST-Hog1的下方也有一个条带，分析原因可能是纯化过程中GST-Hog1融合蛋白断裂后的Hog1蛋白。GST-Hog1融合表达载体的成功构建及GST-Hog1融合蛋白的获得，为后续钓取CsHog1蛋白互作蛋白，深入研究HOG1 MAPK在炭疽菌的功能奠定了基础。 HOG MAPK途径在生物体中与杀菌剂、盐胁迫、生长等密切相关。Hog1作为该途径的关键基因，其所编码的蛋白与其他的蛋白互作共同发挥作用。例如：在芽殖酵母中Hog1p是第一个直接调节Aft1p的激酶，Hog1p-Aft1p相互作用若减少会导致Aft1p去磷酸化从而影响铁的稳态[14]。在白色念珠菌中细胞壁糖苷酶DFG5和DCW1是Hog1磷酸化所必需的[15]。在球孢白僵菌中Bbakr1是Hog1 MAPK通路的下游靶基因，它编码阿尔多酮还原酶，参与调控渗透和盐胁迫，与Bbhog 1关系密切[16]。尽管在多种真菌中HOG MAPK途径已经被较好的研究，但是该信号途径上下游网络并不十分清楚。炭疽菌HOG MAPK信号途经与咯菌腈等吡咯类杀菌剂及盐胁迫等方面也密切相关[17]，但炭疽菌是如何通过HOG信号途径调控对杀菌剂的抗性，其中有哪些关键调控基因，它们的作用机制如何仍是未知。本研究成功获得HOG MAPK途径重要成员CsHog1蛋白，为钓取与CsHog1蛋白互作的蛋白以及丰富HOG MAPK 信号网络成员奠定基础。
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