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摘要：果蝇是一种常见的模式生物，在胚胎发育、疾病的发病机制以及基因表达调控等研究中发挥极其重要的作用。果蝇应激反应最主要涉及的是 JNK 信号通路，是一种真核生物进化保守的信号通路。因此研究JNK信号通路中各基因的作用至关重要。本次实验主要目的是将果蝇JNK信号通路中的egr基因进行过表达，观察其对果蝇的影响。本文将对本次实验中egr基因过表达的pUAST载体构建做一个详细说明。
关键词：egr基因;分子克隆;载体构建
果蝇应激反应最主要涉及的是JNK信号通路，该通路是指一种由一系列内在和外在的应激源所诱发的应激活化蛋白激酶途径，是一种真核生物进化保守的信号通路，调控广泛的细胞过程如细胞凋亡等。[1]egr是果蝇中TNF唯一的同源物，启动TNF-JNK通路诱导细胞死亡。[2]本次实验目的是构建果蝇egr基因的过表达质粒，并将其导入果蝇体内并使其表达，观察egr基因过表达对细胞凋亡的影响。
一、基因序列和pUAST载体信息
（一） egr基因序列
从NCBI数据库中选择gene，输入egr选择物种为果蝇，查看genbank序列，得到egr基因的两个变体isoform A和isoform B，使用较长的isoform A来进行引物设计。
（二）pUAST质粒信息
下图为pUAST序列信息，我们可以详细看到质粒载体的多克隆位点及其序列。
二、PCR引物设计
引物设计是用一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成。
引物设计过程中有以下注意要点：
（一）引物长度一般为15—30bp，其有效长度[Ln=2（G十C）十（A十T）]一般不大于38，否则会降低产物的特异性。
（二）G十C含量应在40%一60%之间，PCR扩增中的复性温度一般较Tm值低等于引物的Tm值减去5—10度。
（三）碱基分布尽量保证随机性，应避免连续出现4个以上的单一碱基，尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。
（四）引物不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。
（五）两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。
（六）一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。
（七）引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸，起到保护作用。
本次引物设计使用的软件为primer premier 5.0。通过egr基因CDS序列与pUAST的多克隆位点进行比对，确定限制性核酸内切酶的酶切位点，保证在酶切时不破坏egr基因的编码区。
三、PCR反应
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，DNA双链解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备;2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;3、引物的延伸：DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对原则合成一条新的互补链;4、重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。[4]
实验中先将果蝇的总RNA提取出来，然后进行反转录得到cDNA。在PCR反应体系中依次加入以下试剂：10 x PCR buffer 2.5μl，dNTP 2μl，cDNA 2μl，上游引物1μl，下游引物1μl，DNA Polymerase 0.5μl（必须选用高保真的DNA聚合酶），ddH2O 16μl。经过变性、退火、延伸步骤后，得到扩增的DNA序列。制作1%琼脂糖凝胶，用PCR产物进行电泳，电泳后进行切胶回收。
四、目的基因插入载体
先将PCR扩增得到的egr基因和pUAST质粒进行双酶切，然后进行电泳来分离酶切后的线性质粒和未被酶切的质粒，通过凝胶纯化来纯化回收。使用DNA连接酶将带有粘末端的egr基因和线性质粒连接，得到egr-pUAST质粒。注意最好使连接片段与载体的比为3：1，以保证只有少量的载体发生自连，提高载体构建的效率。然后将egr-pUAST质粒导入感受态的大肠杆菌进行复制转化，将转化后的大肠杆菌涂至含抗生素的琼脂板上，37℃培养过夜。成功转化的大肠杆菌可以在琼脂板上形成菌落，挑取多个单克隆菌落接种到含培养液的管中，在摇床培养箱中扩增。扩增后的少量培养物在编号的琼脂板上涂板，其余用于质粒纯化后用限制性核酸内切酶进行切割，将切割后的产物进行凝胶电泳来确定大肠杆菌转化的使含插入片段的质粒而非自连的质粒。将确定含插入片段质粒的大肠杆菌进一步扩大培养，然后将质粒纯化。最后将所得的片段进行测序，验证目的基因得到了克隆，然后保种。[3]
五、总结
本次实验将用到分子克隆这一技术，将egr基因插入到pUAST质粒后导入果蝇中，让egr基因在果蝇中进行过表达，观察egr基因过表达后对果蝇产生的影响。总结目前所做的工作可以发现，引物设计是该实验中最困难、也是最容易出现问题的地方。另外，酶切位点的寻找和选择也是一项技术性工作。在今后的实验中要加强对相关内容的学习和操作，以便能成功学好分子克隆这项技术。
参考文献：
[1]唐成晨，贾佳.果蝇JNK信号通路的研究进展[J].生物学杂志，2019，36（03）：78-82.
[2]薛奋勤，许晴，魏华， 等.仅采用 PCR 进行分子克隆的方法探索[J].首都医科大学学报，2014，
作者简介：
唐鹏程 王继善 王永赛，临沂大学。
关键词：egr基因;分子克隆;载体构建
果蝇应激反应最主要涉及的是JNK信号通路，该通路是指一种由一系列内在和外在的应激源所诱发的应激活化蛋白激酶途径，是一种真核生物进化保守的信号通路，调控广泛的细胞过程如细胞凋亡等。[1]egr是果蝇中TNF唯一的同源物，启动TNF-JNK通路诱导细胞死亡。[2]本次实验目的是构建果蝇egr基因的过表达质粒，并将其导入果蝇体内并使其表达，观察egr基因过表达对细胞凋亡的影响。
一、基因序列和pUAST载体信息
（一） egr基因序列
从NCBI数据库中选择gene，输入egr选择物种为果蝇，查看genbank序列，得到egr基因的两个变体isoform A和isoform B，使用较长的isoform A来进行引物设计。
（二）pUAST质粒信息
下图为pUAST序列信息，我们可以详细看到质粒载体的多克隆位点及其序列。
二、PCR引物设计
引物设计是用一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成。
引物设计过程中有以下注意要点：
（一）引物长度一般为15—30bp，其有效长度[Ln=2（G十C）十（A十T）]一般不大于38，否则会降低产物的特异性。
（二）G十C含量应在40%一60%之间，PCR扩增中的复性温度一般较Tm值低等于引物的Tm值减去5—10度。
（三）碱基分布尽量保证随机性，应避免连续出现4个以上的单一碱基，尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。
（四）引物不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。
（五）两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。
（六）一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。
（七）引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸，起到保护作用。
本次引物设计使用的软件为primer premier 5.0。通过egr基因CDS序列与pUAST的多克隆位点进行比对，确定限制性核酸内切酶的酶切位点，保证在酶切时不破坏egr基因的编码区。
三、PCR反应
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，DNA双链解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备;2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;3、引物的延伸：DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对原则合成一条新的互补链;4、重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。[4]
实验中先将果蝇的总RNA提取出来，然后进行反转录得到cDNA。在PCR反应体系中依次加入以下试剂：10 x PCR buffer 2.5μl，dNTP 2μl，cDNA 2μl，上游引物1μl，下游引物1μl，DNA Polymerase 0.5μl（必须选用高保真的DNA聚合酶），ddH2O 16μl。经过变性、退火、延伸步骤后，得到扩增的DNA序列。制作1%琼脂糖凝胶，用PCR产物进行电泳，电泳后进行切胶回收。
四、目的基因插入载体
先将PCR扩增得到的egr基因和pUAST质粒进行双酶切，然后进行电泳来分离酶切后的线性质粒和未被酶切的质粒，通过凝胶纯化来纯化回收。使用DNA连接酶将带有粘末端的egr基因和线性质粒连接，得到egr-pUAST质粒。注意最好使连接片段与载体的比为3：1，以保证只有少量的载体发生自连，提高载体构建的效率。然后将egr-pUAST质粒导入感受态的大肠杆菌进行复制转化，将转化后的大肠杆菌涂至含抗生素的琼脂板上，37℃培养过夜。成功转化的大肠杆菌可以在琼脂板上形成菌落，挑取多个单克隆菌落接种到含培养液的管中，在摇床培养箱中扩增。扩增后的少量培养物在编号的琼脂板上涂板，其余用于质粒纯化后用限制性核酸内切酶进行切割，将切割后的产物进行凝胶电泳来确定大肠杆菌转化的使含插入片段的质粒而非自连的质粒。将确定含插入片段质粒的大肠杆菌进一步扩大培养，然后将质粒纯化。最后将所得的片段进行测序，验证目的基因得到了克隆，然后保种。[3]
五、总结
本次实验将用到分子克隆这一技术，将egr基因插入到pUAST质粒后导入果蝇中，让egr基因在果蝇中进行过表达，观察egr基因过表达后对果蝇产生的影响。总结目前所做的工作可以发现，引物设计是该实验中最困难、也是最容易出现问题的地方。另外，酶切位点的寻找和选择也是一项技术性工作。在今后的实验中要加强对相关内容的学习和操作，以便能成功学好分子克隆这项技术。
参考文献：
[1]唐成晨，贾佳.果蝇JNK信号通路的研究进展[J].生物学杂志，2019，36（03）：78-82.
[2]薛奋勤，许晴，魏华， 等.仅采用 PCR 进行分子克隆的方法探索[J].首都医科大学学报，2014，
作者简介：
唐鹏程 王继善 王永赛，临沂大学。