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【摘 要】 目的：建立紫金龙药材HPLC指纹图谱分析方法，为紫金龙药材的质量评价提供依据。方法：采用RP-HPLC色谱法，Inertsil ODS-SP（4.6mm×150mm，5μm）色谱柱，以甲醇-0.2%磷酸水溶液（三乙胺调pH为7.0）为流动相梯度洗脱，柱温35℃，流速1.0ml/min，检测波长采用波长切换，0～40min为230nm，40～90min切换至285nm，进样量10μl；数据使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版（2012A） 进行处理。结果：在选定的色谱条件下确定10个峰构成紫金龙药材的特征共有峰，各批次药材均具有上述特征，但特征峰的相对含量分布差异导致色谱概貌存在一定差异。结论：该方法简便、精密度高、重现性好，可为紫金龙药材的质量评价提供依据。
【关键词】 白族药；紫金龙；特征图谱；HPLC
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）04-0001-03
Abstract：Objective To establish the HPLC fingerprint of Dactylicapnos scandentis radix and to research the quality of Dactylicapnos scandentis radix.Methods The gradient elution and multiple wavelength mode was applied in chromatographic separation，and chromatographic fingerprint similarity evaluation software（2012A） was used to analyse data.Results 10 peaks were identified as the characteristic fingerprints of Dactylicapnos scandentis radix. All samples tested contained the same 10 peaks， but the content of each peak showed great difference among the samples，which resulted in the differences on their chromatograms.Conclusion This method is simple，accurate with good reproducibility，and can be used for the quality control of Dactylicapnos scandentis radix.
Keywords：Traditional Bai Medicine；Dactylicapnos Scandentis Radix；Fingerprint；HPLC
白族药滋坚伦（白语：Zixjieilht）为罂粟科植物紫金龙Dactylicapnos scandens （D.Don） Hutch.的根，别名串枝莲、碗豆七，夏秋采集其根，晒干后入药。其味苦、性凉，有毒，具有消炎、止痛镇痛、止血、降压的功效，白族民间用于胃痛、神经性头痛、牙痛、外伤肿痛、外伤出血、高血压等。在我国西南地区民间广泛用于牙痛、神经性头痛、胃痛和止血，临床表明具有较好的镇痛作用[1-5]。紫金龙含有多种生物碱，主含普罗托品、异紫堇定等[6-8]。中药材指纹图谱是近年来被国际公认的控制中药或天然药物质量的有效方法，其优点在于较全面反映中药复杂的化学成分及其相对比例。研究采用反相高效液相色谱法建立紫金龙药材的特征指纹图谱，为该药材的质量评价提供依据[9]。
1 仪器与材料
1.1 仪器 安捷伦1200高效液相色谱仪（包括自动进样器、DAD紫外检测器、HP 色谱工作站等）；GWA-UN2-C30纯水器；CQ-250超声波清洗仪；岛津AND GH-252电子天平。
1.2 材料 紫金龙药材经大理州食品药品检验所杨怀镜主任药师鉴定为罂粟科植物紫金龙Dactylicapnos scandens（D.Don）Hutch.的干燥根，所测样品见表1；原阿片碱（批号：110853-200402，中国药品生物制品检定所）；近视乐眼药水（市场抽样合格制剂）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱为Inertsil ODS-SP（4.6mm×150mm，5μm）；流动相A相为0.2%磷酸水溶液（三乙胺调pH为7.0），B相为甲醇，梯度洗脱，见表2；柱温：35℃；流速：1.0ml/min；检测波长：0～40min波长为230nm，40～90min切换至285nm；进样量：紫金龙（1～12）进样10μl，原阿片碱对照品进样5μl，近视乐眼药水参照物溶液进样5μl。
2.2 对照品溶液制备 精密称取原阿片碱对照品5.46mg置10ml量瓶，加甲醇定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤后作为对照品溶液，进样5μl，见图1；取近视乐眼药水2ml用水稀释至50ml的容量瓶中，摇匀，微孔滤膜过滤后作为参照物溶液进样5μl，记录色谱图，见图2。
2.3 供试品溶液制备 精密称取60℃干燥至恒重的紫金龙粉末2g（过40目筛），置具塞锥形瓶中，加入氨水将其润湿，放置30min，加甲醇和氯仿（1∶1）混合溶液20ml，超声提取30min，放冷后，滤过，蒸干，残渣用甲醇分次溶解，转移至10ml量瓶中并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤后进样10μl，记录色谱图，见图3。
2.4 特征图谱评价方法 采用国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版（2012A）。对照图谱生成方法为中位数法，时间窗宽度为0.5min，相似度计算方法为夹角余弦法。 2.5 方法学考察
2.5.1 精密度实验 取同一供试品溶液，连续进样6次，检测指纹图谱，比较各色谱峰的保留时间，结果表明6次进样各共有峰相对保留时间RSD在0.14%～0.38% 之间，相似度在0.990～1 之间，符合指纹图谱研究技术的要求。
[JP+1]2.5.2 重复性实验 取同一批紫金龙药材6 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别检测指纹图谱，结果表明各共有峰保留时间RSD在0.12%～0.45%之间，相似度在0.992～0.999之间，符合指纹图谱研究技术的要求。
2.5.3 稳定性实验 取同一批供试品溶液，分别于0、2、4、 8、12、24h 检测指纹图谱，结果表明各特征峰无明显差异，各色谱峰共有峰保留时间RSD在0.15%～0.44%之间，相似度在0.999～1，表明样品溶液在24h内稳定。
2.6 结果
2.6.1 图谱测定时间的确定 取样品溶液5μl，注入高效液相色谱仪，记录120min内色谱图，结果表明，90min 后无特征峰出现，故确定图谱记录时间为90min。
2.6.2 空白实验 取甲醇溶液5μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果表明，空白无干扰。
2.6.3 样品特征图谱测定 取表1中的样品，按“2.3”项下方法获得供试溶液，进样10μl，记录HPLC色谱图，结果见图4。
2.6.4 共有峰的确定及相似度计算 根据12批紫金龙药材特征图谱的检测结果，按“2.4”项下方法，以紫金龙对照药材S12为参照图谱，全谱峰匹配，生成紫金龙药材对照特征图谱（见图4 R） ，其中共匹配出10个峰（见图3），构成紫金龙药材的特征共有峰。通过与对照品图谱比对，指认4号峰为原阿片碱峰，6号峰为近视乐眼药水参照物峰。因原阿片碱峰面积适中且峰形稳定故以其为参照峰，利用该软件对12 批特征图谱进行数据处理，各共有峰相对保留时间RSD在0.15%～0.44% 之间，各批次相似度值高，结果见表3 所示。可以看出，12批紫金龙药材特征图谱的相似度均>0.9，说明不同来源的紫金龙药材具有较高的均一性。
2.6.5 样品特征图谱分析 由于标准品有限，实验未对其他特征峰进行指认与分析。本实验测试样品包括了不同产地、不同类型（栽培、野生及商品药材）的紫金龙，其HPLC特征图谱均具有上述特征峰，相互间吻合较好，可作为紫金龙的特征指纹。
3 讨论
3.1 提取方法的选择 实验以尽可能多体现紫金龙主要成分为原则，设计样品溶液制备方法。分别选取体积分数为70%乙醇、甲醇、氯仿为提取溶媒，对提取物HPLC图谱分析，但效果都不理想。可能是由于紫金龙中生物碱在极性和含量上差异较大，很难用单一的溶媒取得满意的效果。考虑碱性条件易于生物碱的溶出，所得峰较多，故比较氨水润湿时间的长短对实验结果的影响。结果表明，氨水润湿30min后制备的供试品中峰形最佳。实验还考察了超声20、30、40、50min提取效果，结果提示，超声提取30min及以上，所得各峰响应值较高且无明显差异。所以实验采用加氨水润湿30min后，加20ml甲醇和氯仿（1∶1）混合溶液，超声提取30min，作为供试液制备方法[10-12]。
3.2 流动相的选择 实验考察了多种流动相：甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸水溶液（三乙胺调pH至7.0）、甲醇-0.005mol/L磷酸氢二钠溶液（三乙胺调节pH值至9.0）。结果表明，甲醇-0.2%磷酸水溶液（三乙胺调pH至7.0）系统中色谱峰多且峰形较好，所以选择该流动相系统。
实验中考察了Phenomenex Synergi Polar-RP 80A（250mm×4.6mm，4μm）、CAPCELL PAK C18（150mm×4.6mm，5μm）、Inertsil ODS-SP（4.6mm×150mm，5μm）三根不同厂家的色谱柱，结果表明采用Inertsil ODS-SP（4.6mm×150mm，5μm）色谱柱所得图谱基线平稳，色谱峰数目较多，分离度，峰形好，因此选用该柱进行特征图谱研究。
3.3 检测波长及柱温的选择 实验从200～400nm内挑选了210、230、245、275、285、320、340、370nm 波长显示色谱图，并记录全谱段三维图谱。结果在低波长色谱段基线不平，检测波长为230nm时，在40min后色谱峰较为稀疏且特征峰6过高，此时将检测波长切换为285nm，得到峰数较多，同时解决了特征峰6过高问题，最后结合三维图谱，选择用波长切换的方法对其进行分析，即0～40min检测波长为230nm，40～90min检测波长为285nm，使色谱峰尽可能得到体现。
实验比较了四个不同柱温下的色谱图（25、30、35、40℃），发现随柱温上升，各色谱峰变化不明显，故选择35℃为指纹图谱的检测柱温。
3.4 特征图谱相似度评价 实验采用了HPLC 对紫金龙进行分析，各样品HPLC 特征图谱虽存在一定差异，但均具有相同的色谱特征峰，所建立的特征图谱具有稳定性和可控性。不同来源的紫金龙药材分析结果可以看出，各色谱峰的保留时间匹配好，特征峰含量分布差异较大，以全谱峰匹配方式计算相似度，各批次差异较大，但在选定的色谱条件下以两个已知特征峰：特征峰4（原阿片碱）、特征峰6作为多点校正，Mark峰匹配方式计算相似度，则各批次相似度高，表明紫金龙药材色谱图中特征峰4、特征峰6含量稳定，其余特征峰含量个体差异较大。
参考文献
[1]南京中医药大学.中药大辞典（下册）[M].上海：上海科学技术出版社，2006：3291.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].1977：586.
[3]大理州白族自治州人民政府.大理中药资源志[M].昆明：云南民族出版社，1991：83.
[4]钱信忠.有毒中草药大辞典[M].天津.天津科技翻译出版公司，1992：561.
[5]张文鑫，韩丽妹，周毅生，等.RP-HPLC同时测定紫金龙中四种异喹啉生物碱的含量[J].中国药学杂志 2009，44（3）：233-236.
[6]吴颖瑞，赵友兴，刘玉清，等.紫金龙的生物碱成分研究[J].天然产物研究与开发，2008，20： 622-626.
[7]钱金栿，周粤.白族草药紫金龙成分的研究[J].西北药学杂志，2000，15（2）：57-58.
[8]罗建蓉，钱金栿，周浓.紫金龙脂溶性化学成分的研究[J].西北药学杂志，2010，25（1）：19-20.
[9]周玉新.中药指纹图谱研究技术[M].北京：化学工业出版社，2002.
[10]宋双红，王喆之，张媛，等.黄芩药材HPLC 指纹图谱的研究[J].中国药学杂志，2006，41（6）：413-417.
[11]简伟杰，段琼，段天璇，等.灯心草药材RP-HPLC指纹图谱研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（10）：60-63.
[12]詹汉英，谢彩娟，杨龙梅，等.不同产地延胡索药材RP-HPLC 指纹图谱及质量研究[J].药物分析杂志，2008，28（6）：884-887.
（收稿日期：2015.12.27）
【关键词】 白族药；紫金龙；特征图谱；HPLC
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）04-0001-03
Abstract：Objective To establish the HPLC fingerprint of Dactylicapnos scandentis radix and to research the quality of Dactylicapnos scandentis radix.Methods The gradient elution and multiple wavelength mode was applied in chromatographic separation，and chromatographic fingerprint similarity evaluation software（2012A） was used to analyse data.Results 10 peaks were identified as the characteristic fingerprints of Dactylicapnos scandentis radix. All samples tested contained the same 10 peaks， but the content of each peak showed great difference among the samples，which resulted in the differences on their chromatograms.Conclusion This method is simple，accurate with good reproducibility，and can be used for the quality control of Dactylicapnos scandentis radix.
Keywords：Traditional Bai Medicine；Dactylicapnos Scandentis Radix；Fingerprint；HPLC
白族药滋坚伦（白语：Zixjieilht）为罂粟科植物紫金龙Dactylicapnos scandens （D.Don） Hutch.的根，别名串枝莲、碗豆七，夏秋采集其根，晒干后入药。其味苦、性凉，有毒，具有消炎、止痛镇痛、止血、降压的功效，白族民间用于胃痛、神经性头痛、牙痛、外伤肿痛、外伤出血、高血压等。在我国西南地区民间广泛用于牙痛、神经性头痛、胃痛和止血，临床表明具有较好的镇痛作用[1-5]。紫金龙含有多种生物碱，主含普罗托品、异紫堇定等[6-8]。中药材指纹图谱是近年来被国际公认的控制中药或天然药物质量的有效方法，其优点在于较全面反映中药复杂的化学成分及其相对比例。研究采用反相高效液相色谱法建立紫金龙药材的特征指纹图谱，为该药材的质量评价提供依据[9]。
1 仪器与材料
1.1 仪器 安捷伦1200高效液相色谱仪（包括自动进样器、DAD紫外检测器、HP 色谱工作站等）；GWA-UN2-C30纯水器；CQ-250超声波清洗仪；岛津AND GH-252电子天平。
1.2 材料 紫金龙药材经大理州食品药品检验所杨怀镜主任药师鉴定为罂粟科植物紫金龙Dactylicapnos scandens（D.Don）Hutch.的干燥根，所测样品见表1；原阿片碱（批号：110853-200402，中国药品生物制品检定所）；近视乐眼药水（市场抽样合格制剂）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱为Inertsil ODS-SP（4.6mm×150mm，5μm）；流动相A相为0.2%磷酸水溶液（三乙胺调pH为7.0），B相为甲醇，梯度洗脱，见表2；柱温：35℃；流速：1.0ml/min；检测波长：0～40min波长为230nm，40～90min切换至285nm；进样量：紫金龙（1～12）进样10μl，原阿片碱对照品进样5μl，近视乐眼药水参照物溶液进样5μl。
2.2 对照品溶液制备 精密称取原阿片碱对照品5.46mg置10ml量瓶，加甲醇定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤后作为对照品溶液，进样5μl，见图1；取近视乐眼药水2ml用水稀释至50ml的容量瓶中，摇匀，微孔滤膜过滤后作为参照物溶液进样5μl，记录色谱图，见图2。
2.3 供试品溶液制备 精密称取60℃干燥至恒重的紫金龙粉末2g（过40目筛），置具塞锥形瓶中，加入氨水将其润湿，放置30min，加甲醇和氯仿（1∶1）混合溶液20ml，超声提取30min，放冷后，滤过，蒸干，残渣用甲醇分次溶解，转移至10ml量瓶中并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤后进样10μl，记录色谱图，见图3。
2.4 特征图谱评价方法 采用国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版（2012A）。对照图谱生成方法为中位数法，时间窗宽度为0.5min，相似度计算方法为夹角余弦法。 2.5 方法学考察
2.5.1 精密度实验 取同一供试品溶液，连续进样6次，检测指纹图谱，比较各色谱峰的保留时间，结果表明6次进样各共有峰相对保留时间RSD在0.14%～0.38% 之间，相似度在0.990～1 之间，符合指纹图谱研究技术的要求。
[JP+1]2.5.2 重复性实验 取同一批紫金龙药材6 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别检测指纹图谱，结果表明各共有峰保留时间RSD在0.12%～0.45%之间，相似度在0.992～0.999之间，符合指纹图谱研究技术的要求。
2.5.3 稳定性实验 取同一批供试品溶液，分别于0、2、4、 8、12、24h 检测指纹图谱，结果表明各特征峰无明显差异，各色谱峰共有峰保留时间RSD在0.15%～0.44%之间，相似度在0.999～1，表明样品溶液在24h内稳定。
2.6 结果
2.6.1 图谱测定时间的确定 取样品溶液5μl，注入高效液相色谱仪，记录120min内色谱图，结果表明，90min 后无特征峰出现，故确定图谱记录时间为90min。
2.6.2 空白实验 取甲醇溶液5μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果表明，空白无干扰。
2.6.3 样品特征图谱测定 取表1中的样品，按“2.3”项下方法获得供试溶液，进样10μl，记录HPLC色谱图，结果见图4。
2.6.4 共有峰的确定及相似度计算 根据12批紫金龙药材特征图谱的检测结果，按“2.4”项下方法，以紫金龙对照药材S12为参照图谱，全谱峰匹配，生成紫金龙药材对照特征图谱（见图4 R） ，其中共匹配出10个峰（见图3），构成紫金龙药材的特征共有峰。通过与对照品图谱比对，指认4号峰为原阿片碱峰，6号峰为近视乐眼药水参照物峰。因原阿片碱峰面积适中且峰形稳定故以其为参照峰，利用该软件对12 批特征图谱进行数据处理，各共有峰相对保留时间RSD在0.15%～0.44% 之间，各批次相似度值高，结果见表3 所示。可以看出，12批紫金龙药材特征图谱的相似度均>0.9，说明不同来源的紫金龙药材具有较高的均一性。
2.6.5 样品特征图谱分析 由于标准品有限，实验未对其他特征峰进行指认与分析。本实验测试样品包括了不同产地、不同类型（栽培、野生及商品药材）的紫金龙，其HPLC特征图谱均具有上述特征峰，相互间吻合较好，可作为紫金龙的特征指纹。
3 讨论
3.1 提取方法的选择 实验以尽可能多体现紫金龙主要成分为原则，设计样品溶液制备方法。分别选取体积分数为70%乙醇、甲醇、氯仿为提取溶媒，对提取物HPLC图谱分析，但效果都不理想。可能是由于紫金龙中生物碱在极性和含量上差异较大，很难用单一的溶媒取得满意的效果。考虑碱性条件易于生物碱的溶出，所得峰较多，故比较氨水润湿时间的长短对实验结果的影响。结果表明，氨水润湿30min后制备的供试品中峰形最佳。实验还考察了超声20、30、40、50min提取效果，结果提示，超声提取30min及以上，所得各峰响应值较高且无明显差异。所以实验采用加氨水润湿30min后，加20ml甲醇和氯仿（1∶1）混合溶液，超声提取30min，作为供试液制备方法[10-12]。
3.2 流动相的选择 实验考察了多种流动相：甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸水溶液（三乙胺调pH至7.0）、甲醇-0.005mol/L磷酸氢二钠溶液（三乙胺调节pH值至9.0）。结果表明，甲醇-0.2%磷酸水溶液（三乙胺调pH至7.0）系统中色谱峰多且峰形较好，所以选择该流动相系统。
实验中考察了Phenomenex Synergi Polar-RP 80A（250mm×4.6mm，4μm）、CAPCELL PAK C18（150mm×4.6mm，5μm）、Inertsil ODS-SP（4.6mm×150mm，5μm）三根不同厂家的色谱柱，结果表明采用Inertsil ODS-SP（4.6mm×150mm，5μm）色谱柱所得图谱基线平稳，色谱峰数目较多，分离度，峰形好，因此选用该柱进行特征图谱研究。
3.3 检测波长及柱温的选择 实验从200～400nm内挑选了210、230、245、275、285、320、340、370nm 波长显示色谱图，并记录全谱段三维图谱。结果在低波长色谱段基线不平，检测波长为230nm时，在40min后色谱峰较为稀疏且特征峰6过高，此时将检测波长切换为285nm，得到峰数较多，同时解决了特征峰6过高问题，最后结合三维图谱，选择用波长切换的方法对其进行分析，即0～40min检测波长为230nm，40～90min检测波长为285nm，使色谱峰尽可能得到体现。
实验比较了四个不同柱温下的色谱图（25、30、35、40℃），发现随柱温上升，各色谱峰变化不明显，故选择35℃为指纹图谱的检测柱温。
3.4 特征图谱相似度评价 实验采用了HPLC 对紫金龙进行分析，各样品HPLC 特征图谱虽存在一定差异，但均具有相同的色谱特征峰，所建立的特征图谱具有稳定性和可控性。不同来源的紫金龙药材分析结果可以看出，各色谱峰的保留时间匹配好，特征峰含量分布差异较大，以全谱峰匹配方式计算相似度，各批次差异较大，但在选定的色谱条件下以两个已知特征峰：特征峰4（原阿片碱）、特征峰6作为多点校正，Mark峰匹配方式计算相似度，则各批次相似度高，表明紫金龙药材色谱图中特征峰4、特征峰6含量稳定，其余特征峰含量个体差异较大。
参考文献
[1]南京中医药大学.中药大辞典（下册）[M].上海：上海科学技术出版社，2006：3291.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].1977：586.
[3]大理州白族自治州人民政府.大理中药资源志[M].昆明：云南民族出版社，1991：83.
[4]钱信忠.有毒中草药大辞典[M].天津.天津科技翻译出版公司，1992：561.
[5]张文鑫，韩丽妹，周毅生，等.RP-HPLC同时测定紫金龙中四种异喹啉生物碱的含量[J].中国药学杂志 2009，44（3）：233-236.
[6]吴颖瑞，赵友兴，刘玉清，等.紫金龙的生物碱成分研究[J].天然产物研究与开发，2008，20： 622-626.
[7]钱金栿，周粤.白族草药紫金龙成分的研究[J].西北药学杂志，2000，15（2）：57-58.
[8]罗建蓉，钱金栿，周浓.紫金龙脂溶性化学成分的研究[J].西北药学杂志，2010，25（1）：19-20.
[9]周玉新.中药指纹图谱研究技术[M].北京：化学工业出版社，2002.
[10]宋双红，王喆之，张媛，等.黄芩药材HPLC 指纹图谱的研究[J].中国药学杂志，2006，41（6）：413-417.
[11]简伟杰，段琼，段天璇，等.灯心草药材RP-HPLC指纹图谱研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（10）：60-63.
[12]詹汉英，谢彩娟，杨龙梅，等.不同产地延胡索药材RP-HPLC 指纹图谱及质量研究[J].药物分析杂志，2008，28（6）：884-887.
（收稿日期：2015.12.27）