【摘 要】
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[目的]克隆裂殖酵母pmt3基因,利用大肠杆菌过量表达Pmt3重组蛋白,并进行Pmt3蛋白的纯化及晶体培养.[方法]利用PCR体外扩增pmt3基因的编码序列,通过NdeⅠ和BamH Ⅰ限制性酶切
【机 构】
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济宁医学院行为医学教育研究所,山东济宁272067;济宁医学院护理学院,山东济宁272067;济宁医学院精准医学研究院,山东省高等学校肿瘤精准医学重点实验窒,山东济宁272067
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[目的]克隆裂殖酵母pmt3基因,利用大肠杆菌过量表达Pmt3重组蛋白,并进行Pmt3蛋白的纯化及晶体培养.[方法]利用PCR体外扩增pmt3基因的编码序列,通过NdeⅠ和BamH Ⅰ限制性酶切和Solution Ⅰ连接技术将其克隆至pET28a载体,利用大肠杆菌Rosetta(DE3)表达Pmt3重组蛋白,利用Ni-NTA亲和层析柱HisTrap(5 mL)和分子筛层析柱Superdex 75 (16/60)依次纯化目的蛋白,利用超滤离心管进行蛋白质的浓缩,采用48孔板坐滴气相扩散法进行蛋白晶体初筛.[结果]在16℃恒温条件下经0.3 mmol/L IPTG诱导后Pmt3蛋白过量表达.经Ni-NTA亲和层析和Superdex 75分子筛层析纯化得到了高纯度的Pmt3蛋白,最终蛋白浓缩至9.5 mg/mL.经96条件蛋白结晶条件筛选,在18℃恒温稳定条件下获得了Pmt3蛋白晶体.结晶条件为:0.1 mol/L sodium acetate trihydrate,pH 4.6,8％ polyethyleneglycol 4000.[结论]裂殖酵母Pmt3蛋白在16℃条件下在大肠杆菌中被IPTG诱导表达.经亲和层析和分子筛层析两步纯化,获得了纯化的重组Pmt3蛋白.经96结晶条件18℃培养后,获得了蛋白质棒状晶体,为后续Pmt3的功能研究及三维结构的解析提供基础.
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