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【目的】为获得高启动效率的乳腺特异启动子,对荷斯坦奶牛、娟姗牛和奶水牛的β-酪蛋白基因启动子进行比较研究。【方法】对Genbank中所收录的荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子序列进行比对分析,按照保守序列分别设计启动子区和3′端ploy A序列引物,同时设计人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列引物并引入预先设计的酶切位点以方便载体构建。采集静脉血液,提取基因组DNA。PCR克隆β-酪蛋白基因启动子区和3′端ploy A区,同时以实验室保存质粒为模板克隆人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列。测序正确后,将各片段按设计顺序依次插入p MD18-T骨架中,构建成p HSTBCNp-IFN,p JSBCNp-IFN和p SNBCNp-IFN乳腺特异表达载体。将各载体转染Bcap-37细胞,经G418筛选出稳定整合的转基因细胞系。用胰岛素(1 mg·L-1),转铁蛋白因子(1 mg·L-1),氢化可的松(1 mg·L-1)和PRL(250IU·L-1)联合对转基因细胞系进行诱导,然后用PCR、Western blotting、QRT-PCR技术和ELISA方法分别在m RNA水平和蛋白质水平检测IFNα-2b的表达。【结果】PCR后获得了荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子区,长度分别为5 219、5 244和5 216 bp,其中包括了第一外显子,第一内含子和部分第二外显子,部分第二外显子的51个碱基编码17个氨基酸的信号肽序列。克隆了1 166 bp的ploy A区序列。最终将构建的3个乳腺特异表达载体转染Bcap-37细胞并经过G418筛选后,获得了3个转基因细胞系。经激素诱导后,PCR、Western blotting、QRT-PCR和ELISA检测发现3个转基因细胞系都表达了IFNα-2b基因,并且发现娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控IFNα-2b基因的表达上效率较高,在m RNA水平和蛋白质水平上显著高于其他两个启动子(P<0.05)。【结论】娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控外源基因表达上具有较高的效率,是具有应用前景的乳腺特异性启动子。所构建的表达载体为IFNα-2b转基因动物乳腺生物反应器的制备奠定基础。