【摘 要】
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目的 构建稳定过表达人解偶联蛋白2 (UCP2)的张氏肝细胞株,观察UCP2对线粒体膜电位(MMP)和活性氧(ROS)的作用. 方法 将含有人UCP2 cDNA全长的重组质粒(pcDNA3.1-hU CP2)转染
【基金项目】
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辽宁省自然科学基金;教育部留学回国人员科研启动基金
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目的 构建稳定过表达人解偶联蛋白2 (UCP2)的张氏肝细胞株,观察UCP2对线粒体膜电位(MMP)和活性氧(ROS)的作用. 方法 将含有人UCP2 cDNA全长的重组质粒(pcDNA3.1-hU CP2)转染张氏肝细胞系,pcDNA3.1空载体作为对照.Zeocin筛选稳定表达UCP2的细胞株,Western blot和免疫细胞化学鉴定UCP2蛋白表达.利用不同剂量UCP2抑制剂京尼平(25、50、100μmol/L),预处理稳定表达UCP2的细胞株.荧光分光光度法检测MMP和ROS水平变化.数据分析用单因素方差分析和q检验(Newman-keuls法),P＜0.05为差异有统计学意义.结果 pcDNA3.1-hU CP2成功转染张氏肝细胞,UCP2相对表达量约为对照组的1.6倍.过表达细胞罗丹明123和2 ′,7 ′ -二氯氢化荧光素二脂荧光强度(分别为11.11±2.76和4.97±0.62)均明显低于正常对照组张氏肝细胞(分别为15.56±2.55和6.14±1.25,q值分别为4.80和3.35,P＜0.01和P＜ 0.05)和空载体对照组肝细胞(分别为16.11±2.93和6.23±1.13,q值分别为5.40和3.60,P＜0.01和P＜ 0.05)；空载体组上述两指标与正常对照组相比,差异均无统计学意义.京尼平低、中、高剂量组与过表达组相比,罗丹明123的荧光强度(分别为14.89±2.89,17.89±2.93,24.00±2.55,q值分别为4.08,7.33和13.93,P值均＜0.01)和2 ′,7 ′-二氯氢化荧光素二脂的荧光强度(分别为9.16±0.78,10.84±1.09, 11.83±1.25,q值分别为12.00,16.83和19.67,P值均＜0.01)均明显升高,并呈现剂量依赖性.结论 成功构建稳定过表达人U CP2的张氏肝细胞株,UCP2表达水平及活性变化可通过MMP和ROS影响线粒体功能.
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