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摘要 在广东省园林植物线虫调查期间，从粉单竹Bambusa chungii根部土壤中分离到一种螺旋线虫。经详细的形态学观察和测量数据比较，将其鉴定为尖尾螺旋线虫Helicotylenchus cuspicaudatus，并获得了尖尾螺旋线虫rDNA的28S D2-D3区和ITS序列，为今后螺旋线虫的种类鉴定提供了分子数据。尖尾螺旋线虫为中国新记录种。
关键词 粉单竹； 尖尾螺旋线虫； 形态学； 分子特征； 新记录种
中图分类号： S 432.45
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2017492
Abstract A species of spiral nematode was isolated from the rhizosphere soil of Bambusa chungii during the survey of parasitic nematodes associated with landscape plants in Guangdong Province. The detailed morphological study confirmed the species as Helicotylenchus cuspicaudatus. The fragments of rDNA 28S D2-D3 and ITS were amplified and sequenced， which provided molecular characters for rapid and accurate identification of this species in the future. H. cuspicaudatus was reported in China for the first time.
Key words Bambusa chungii； Helicotylenchus cuspicaudatus； morphology； molecular characterization； first-record species
螺旋線虫属Helicotylenchus 是Steiner 1945年建立的，该属大多数种类是迁移性外寄生线虫，通过口针刺破根表皮取食；少数种类是半内寄生线虫，有的种类甚至能够完全进入根内生活，造成寄主生长受阻，并伴随其他病原物的侵染[12]。螺旋线虫属已报道230个有效种[3]，其寄主种类多样，地理分布广泛[12]。目前中国报道的螺旋线虫有效种约有50个[4]，其中，双宫螺旋线虫H. dihystera （Cobb， 1893） Sher， 1961、双角螺旋线虫H. digonicus Perry， 1959、假强壮螺旋线虫H. pseudorobustus Golden， 1956、多带螺旋线虫H. multicinctus （Cobb， 1893） Golden， 1956和刺桐螺旋线虫H.erythrinae （Zimmermann） Golden， 1956是寄主和分布最广泛的种类。在2015-2017年间，对广东省园林植物的线虫种类进行了调查，从粉单竹Bambusa chungii McClure根围土壤中分离到一种螺旋线虫。通过形态学特征观察、测量和拍照，以及详细的文献比对，最终将其鉴定为尖尾螺旋线虫Helicotylenchus cuspicaudatus，并对该线虫的核糖体DNA（rDNA）的28S D2-D3区和ITS区进行了扩增和测序，分析了螺旋线虫属的系统进化关系。
1 材料与方法
1.1 样品采集
用土壤取样器（宏光仪器，型号：304）分别采集广东省惠州市国营油田林场和华南农业大学树木园的粉单竹根围土壤和根系，取样深度为5～25 cm，每个样品约500 g，装入自封袋，并分别标记为YT07和SCAU。
1.2 线虫分离、标本制作、形态测量和拍照
用贝曼漏斗法分离线虫24～48 h，用胶头滴管将分离出的线虫吸入培养皿中观察。在体视显微镜下，用自制线虫挑针（粘有毛发的竹签）将螺旋线虫挑入装有清水的指形管中，放入60～65℃水浴中2～3 min杀死线虫；加入等体积8%甲醛溶液，固定至少24 h；采用甘油酒精法对线虫进行脱水处理后，制作线虫玻片标本[5]。利用配备尼康数码相机和专业图像分析软件NIS-Elements BR的尼康显微镜（ECLIPSE 90i，Nikon，日本）对线虫进行形态测量和拍照[6]。
1.3 DNA抽提、扩增和测序
利用蛋白酶K法提取单条线虫DNA，具体方法参照Mundo-Ocampo等[7]。扩增rDNA 28S D2-D3区的引物为D2A（5′-ACA AGT ACC GTG AGG GAA AGT-3′）和D3B （5′-TCG GAA GGA ACC AGC TAC TA-3′）[8]，扩增ITS区引物为18S （5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′）和26S （5′TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG-3′）[9]。PCR反应体系参照说明书（Ex Taq，TaKaRa，日本）。PCR程序为：95℃ 预变性5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，39个循环；72℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，用EasyPure PCR Purification Kit（全式金生物，北京）切胶回收产物。将纯化的YT07群体扩增产物直接送至艾基生物技术（广州）有限公司测序，将SCAU群体的扩增产物克隆到T载体（PMD-18T vector，TaKaRa，日本），转化DH5α菌株后，挑取阳性克隆送至上述公司测序。测序结果经序列分析软件Lasergene 7.0 DNAstar拼接编辑后，登录GenBank数据库获取序列号。 1.4 系统进化分析
从GenBank下载螺旋线虫属有关种的28S D2-D3和ITS序列，利用MEGA 6.0 软件中的 ClustalW 程序进行序列比对，用PAUP 4.0 软件分析序列比对文件，用Modeltest 3.7 软件分析后选择核酸替代模型，用MrBayes 3.2软件进行系统进化树构建，Treeview 1.6 软件打开和编辑系统进化树[6]。基于rDNA 28S D2-D3序列构建的螺旋线虫系统进化树，外群为塞氏纽带线虫Hoplolaimus seinhorsti和Hoplolaimus galeatus[10]；基于 rDNA-ITS序列构建的系统进化树，外群为锥尾盘旋线虫Rotylenchus conicaudatus。
2 结果与分析
2.1 形态鉴定结果
通过仔细的形态特征和测计值比较，采自广东省惠州市国营油田林场和华南农业大学树木园粉单竹上的螺旋线虫YT07群体和SCAU群体，均为尖尾螺旋线虫H.cuspicaudatus Saha， Lal， Singh， Kaushal
关键词 粉单竹； 尖尾螺旋线虫； 形态学； 分子特征； 新记录种
中图分类号： S 432.45
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2017492
Abstract A species of spiral nematode was isolated from the rhizosphere soil of Bambusa chungii during the survey of parasitic nematodes associated with landscape plants in Guangdong Province. The detailed morphological study confirmed the species as Helicotylenchus cuspicaudatus. The fragments of rDNA 28S D2-D3 and ITS were amplified and sequenced， which provided molecular characters for rapid and accurate identification of this species in the future. H. cuspicaudatus was reported in China for the first time.
Key words Bambusa chungii； Helicotylenchus cuspicaudatus； morphology； molecular characterization； first-record species
螺旋線虫属Helicotylenchus 是Steiner 1945年建立的，该属大多数种类是迁移性外寄生线虫，通过口针刺破根表皮取食；少数种类是半内寄生线虫，有的种类甚至能够完全进入根内生活，造成寄主生长受阻，并伴随其他病原物的侵染[12]。螺旋线虫属已报道230个有效种[3]，其寄主种类多样，地理分布广泛[12]。目前中国报道的螺旋线虫有效种约有50个[4]，其中，双宫螺旋线虫H. dihystera （Cobb， 1893） Sher， 1961、双角螺旋线虫H. digonicus Perry， 1959、假强壮螺旋线虫H. pseudorobustus Golden， 1956、多带螺旋线虫H. multicinctus （Cobb， 1893） Golden， 1956和刺桐螺旋线虫H.erythrinae （Zimmermann） Golden， 1956是寄主和分布最广泛的种类。在2015-2017年间，对广东省园林植物的线虫种类进行了调查，从粉单竹Bambusa chungii McClure根围土壤中分离到一种螺旋线虫。通过形态学特征观察、测量和拍照，以及详细的文献比对，最终将其鉴定为尖尾螺旋线虫Helicotylenchus cuspicaudatus，并对该线虫的核糖体DNA（rDNA）的28S D2-D3区和ITS区进行了扩增和测序，分析了螺旋线虫属的系统进化关系。
1 材料与方法
1.1 样品采集
用土壤取样器（宏光仪器，型号：304）分别采集广东省惠州市国营油田林场和华南农业大学树木园的粉单竹根围土壤和根系，取样深度为5～25 cm，每个样品约500 g，装入自封袋，并分别标记为YT07和SCAU。
1.2 线虫分离、标本制作、形态测量和拍照
用贝曼漏斗法分离线虫24～48 h，用胶头滴管将分离出的线虫吸入培养皿中观察。在体视显微镜下，用自制线虫挑针（粘有毛发的竹签）将螺旋线虫挑入装有清水的指形管中，放入60～65℃水浴中2～3 min杀死线虫；加入等体积8%甲醛溶液，固定至少24 h；采用甘油酒精法对线虫进行脱水处理后，制作线虫玻片标本[5]。利用配备尼康数码相机和专业图像分析软件NIS-Elements BR的尼康显微镜（ECLIPSE 90i，Nikon，日本）对线虫进行形态测量和拍照[6]。
1.3 DNA抽提、扩增和测序
利用蛋白酶K法提取单条线虫DNA，具体方法参照Mundo-Ocampo等[7]。扩增rDNA 28S D2-D3区的引物为D2A（5′-ACA AGT ACC GTG AGG GAA AGT-3′）和D3B （5′-TCG GAA GGA ACC AGC TAC TA-3′）[8]，扩增ITS区引物为18S （5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′）和26S （5′TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG-3′）[9]。PCR反应体系参照说明书（Ex Taq，TaKaRa，日本）。PCR程序为：95℃ 预变性5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，39个循环；72℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，用EasyPure PCR Purification Kit（全式金生物，北京）切胶回收产物。将纯化的YT07群体扩增产物直接送至艾基生物技术（广州）有限公司测序，将SCAU群体的扩增产物克隆到T载体（PMD-18T vector，TaKaRa，日本），转化DH5α菌株后，挑取阳性克隆送至上述公司测序。测序结果经序列分析软件Lasergene 7.0 DNAstar拼接编辑后，登录GenBank数据库获取序列号。 1.4 系统进化分析
从GenBank下载螺旋线虫属有关种的28S D2-D3和ITS序列，利用MEGA 6.0 软件中的 ClustalW 程序进行序列比对，用PAUP 4.0 软件分析序列比对文件，用Modeltest 3.7 软件分析后选择核酸替代模型，用MrBayes 3.2软件进行系统进化树构建，Treeview 1.6 软件打开和编辑系统进化树[6]。基于rDNA 28S D2-D3序列构建的螺旋线虫系统进化树，外群为塞氏纽带线虫Hoplolaimus seinhorsti和Hoplolaimus galeatus[10]；基于 rDNA-ITS序列构建的系统进化树，外群为锥尾盘旋线虫Rotylenchus conicaudatus。
2 结果与分析
2.1 形态鉴定结果
通过仔细的形态特征和测计值比较，采自广东省惠州市国营油田林场和华南农业大学树木园粉单竹上的螺旋线虫YT07群体和SCAU群体，均为尖尾螺旋线虫H.cuspicaudatus Saha， Lal， Singh， Kaushal