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【摘要】 目的：探索建立符合中医热哮临床发病特点的大鼠模型。方法：雄性SD大鼠40只，随机分为正常组、模型组、麻杏石甘汤组、地塞米松组，每组10只。以卵蛋白联合细菌脂多糖（LPS ）制造大鼠热哮模型。最后观察肺组织病理学形态变化，定量检测肺组织免疫球蛋白IgE和羧肽酶（CP）的表达变化。结果：模型组发生明显肺组织炎症反应，其肺组织中IgE、CP表达水平显著升高（P<0.01）；治疗后，IgE、CP显著降低（P<0.01）。结论：大鼠肺组织中中性粒细胞（PMN）、IgE和CP浓度及肺组织的病理改变可能成为中医热哮动物模型的主要评价指标。
【关键词】 热哮PMNIgECP
【中图分类号】R242【文献标识码】A【文章编号】1671-5160(2014)02-0212-01 中医认为，热哮是风热侵袭于肺，引触“伏痰”，痰随气升，壅阻气道，导致肺失肃降，气道挛急，发为热哮。国外学者发现，哮喘发作患者，感染致哮喘急性发作患者诱导痰中PMN 明显增加，而非感染性哮喘患者痰液则以EOS 增加为主。在此过程中，内有宿痰，外感风热引发感染而致PMN局部募集侵润是热哮发作的关键病机，热哮型白细胞计数、中性粒细胞检测值明显高于其他各型[1]。笔者紧扣这一病机，模拟热哮证的形成条件，探索建立符合中医临床发病规律的热哮病证结合的大鼠模型。
1材料与方法
1.1药物
麻杏石甘汤方药组成：麻黄、杏仁、石膏、炙甘草。饮片来源：安徽中医药大学国医堂制剂中心；地塞米松片：上海信谊药业有限公司产品，批号：0300402。
1.2试剂与仪器
卵白蛋白（sigma），LPS(sigma公司)，醋酸地塞米松片（上海信谊药业有限公司产品）。Rat CP ELISA试剂盒（上海源叶生物技术有限公司），Rat IGE ELISA试剂盒（上海源叶生物技术有限公司），402AI型超声雾化器（上海鱼跃医疗设备有限公司），酶标阅读仪（雷杜），计算机图像分析系统（ipp6.0）。
1.3动物分组、造模及给药
6-8周龄雄性SD大鼠40只，SPF级，体质量180－220g，购于安徽医科大学实验动物中心，许可证号：SCYKB(皖)2011-002。随机分为正常组、模型组、麻杏石甘汤组、地塞米松组，每组10只。
制备热哮模型，除正常组外，各组均在第1、8天腹腔注射10%卵1ml致敏，同时鼻滴40ulLPS稀释液入大鼠双侧鼻孔（终浓度400ug.ml-1），从第15天开始以1%卵蛋白溶液超声雾化诱喘，每次30min，每日一次，连续7天，以大鼠出现发热、烦躁、汗多、口渴、点头、节律性收腹样喘促等现象，提示模型复制成功。正常组参照上述方法，只是致敏与激发时均以生理盐水代替卵蛋白溶液，不用LPS滴鼻。造模成功后，继续雾化激发4周。造模后第21天开始给药。正常组、模型组灌胃等容积的9.0/L氯化钠溶液，地塞米松组灌服[0.405 g.kg-1.d-1]，麻杏石甘汤组灌服[3.78 g·kg-1·d-1]。末次激发2h内，取左肺固定，右肺直接-80℃冻存备用。
1.4病理检测
左上肺用中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察肺组织的病理变化。
1.5IgE、CP的测定（ELISA）：设标准空；加样；温育；配液；洗涤；加酶；温育；洗涤；显色；终止测定各孔的吸光度（OD值）；结果判定：绘制出标准品线性回归曲线；按直线回归方程式计算出样品浓度，再乘以稀释倍数5，即为样品的实际浓度。
1.6统计学方法：采用SPSS17.0统计软件分析。计量资料用均数±标准差（）表示。多组资料比较采用方差分析，组间比较采用LSD，当P＜0.05为有统计学差异，当P＜0.01为有显著性差异。
2结果
2.1病理形态学改变
正常组大鼠肺组织支气管和肺泡结构清晰，气道纤毛上皮排列整齐，管壁完整，无明显炎症改变及胶原纤维沉积，基底膜较薄；模型组大鼠支气管壁增厚，粘膜上皮杯状细胞增生，支气管及肺血管周围有大量炎症细胞浸润，除嗜酸细胞外，还可见较多中性粒细胞、淋巴细胞在气道粘膜及粘膜下浸润，肺泡间隔不同程度增宽，部分断裂；麻杏石甘汤组大鼠支气管壁稍增厚，管腔内见少许粘液，粘膜下、肺泡间质见少量中性粒、嗜酸性粒细胞及淋巴细胞浸润，结构较完整。地塞米松组大鼠管腔结构较完整，支气管管壁稍增厚，支气管周围炎症细胞浸润较模型组减少，粘膜下层及肺泡间质见少许中性粒细胞、嗜酸细胞及淋巴细胞浸润。
2.2一般体征观察；大鼠出现发热、烦躁、口渴、点头、呛咳、节律性收腹样喘促等一系列热哮模型复制成功症状。
2.3肺组织IgE、CP浓度检测（ELISA法）：
结果见表1，模型组与正常组比较， IgE、CP表达均比正常组高（P〈0.01）；治疗组与模型组比较， IgE、CP含量均降低（P〈0.01）。
表1大鼠肺组织IgE、CP表达溶度（ ,n=7，pg.mL-1）
备注：与正常组比较，﹟P<0.05，＊P<0.01；与模型组比较，□P<0.05，△P<0.01。
3讨论
支气管哮喘是由多种炎性细胞及其介质参与的慢性呼吸疾病，我们一直认为导致哮喘的主要致病细胞是嗜酸性粒细胞（EOS），此类嗜酸性粒细胞哮喘（EA）可以被糖皮质激素所抑制。但是近年来出现了以局部中性粒细胞（PMN）侵润为主的炎症，即非嗜酸性粒细胞哮喘（NEA）[3]。此类患者，临床多有感染，出现发热，苔黄，脉数等热证，多为热哮。结合本实验，我们从以下三方面讨论评价热哮模型：中性粒细胞（PMN）评价 ：冷哮患者大多可以确定明确的过敏源, 嗜酸性粒细胞明显增高，多属外源性哮喘。热哮患者大多有呼吸道感染, 多属内源性、混合性哮喘或喘支炎, 其白细胞和中性粒细胞明显增高。因此局部以中性粒细胞为主兼有嗜酸粒细胞和淋巴细胞浸润的气道炎症是热哮模型成功的标志之一，本实验病理检测中热哮模型组中性粒细胞浸润明显，符合此评价标准。刘宗伟等人发现热哮患者的血清总IgE较正常人高[4]，我们的实验结果与其一致。热哮一般伴有感染，因此热哮的免疫反应比其他类型的哮喘高，更容易刺激免疫细胞的大量生成，热哮的IgE水平较健康人显著升高亦是热哮模型成功的标志之一。肥大细胞 (MC)是人速发型过敏反应的主要效应细胞。酶免疫分析法测定cp、类胰蛋白酶、胃蛋白酶，是MC脱颗粒更具有特异性的标志，以上指标在系统性过敏反应病人血清中含量升高，这些变化可作为MC参与疾病发展的准确的临床指征。有学者研究发现肥大细胞羧肽酶更是过敏症的血液新标志物[5]，模型组的CP水平明显高于其他三组，有统计学差异，表明模型组大鼠存在过敏反应，标志热哮模型造模成功。
通过以上指标的检测，可证明模型组为成功的热哮模型。但是推广这个中医热哮动物模型，还需要进一步应用相应的药物进行反证，因此该模型还有待更加深入的探讨评价。
参考文献
[1] 苏成程,章匀,唐艳芬,黄海凤.哮喘病各证型发病特点与微观指标分析[J].山西中医2012,28(3):14-15.
[2]刘静. Th17 细胞参与调控哮喘小鼠中性粒细胞性气道炎症的分子机制研究[D].2011,广西：广西医科大学.27-29.
[3] 夏维,任振义 .中性粒细胞性哮喘研究进展[J].医学研究杂志.2012 ,41 (1): 173-175.
[4] 刘宗伟.气管哮喘中医辨证分型与血清IL-25、总IgE关系的临床研究[D].2009,,南京：南京中医药大学. 22-23.
[5] 潘琼,丁梅芳,张舒,宁颖,刘宏伟,魏红,岳虹霓.变态反应性疾病儿童血浆肥大细胞羧肽酶和类糜蛋白酶含量的检测[J].中国当代儿科杂志.2011，13(10):814-816.
【关键词】 热哮PMNIgECP
【中图分类号】R242【文献标识码】A【文章编号】1671-5160(2014)02-0212-01 中医认为，热哮是风热侵袭于肺，引触“伏痰”，痰随气升，壅阻气道，导致肺失肃降，气道挛急，发为热哮。国外学者发现，哮喘发作患者，感染致哮喘急性发作患者诱导痰中PMN 明显增加，而非感染性哮喘患者痰液则以EOS 增加为主。在此过程中，内有宿痰，外感风热引发感染而致PMN局部募集侵润是热哮发作的关键病机，热哮型白细胞计数、中性粒细胞检测值明显高于其他各型[1]。笔者紧扣这一病机，模拟热哮证的形成条件，探索建立符合中医临床发病规律的热哮病证结合的大鼠模型。
1材料与方法
1.1药物
麻杏石甘汤方药组成：麻黄、杏仁、石膏、炙甘草。饮片来源：安徽中医药大学国医堂制剂中心；地塞米松片：上海信谊药业有限公司产品，批号：0300402。
1.2试剂与仪器
卵白蛋白（sigma），LPS(sigma公司)，醋酸地塞米松片（上海信谊药业有限公司产品）。Rat CP ELISA试剂盒（上海源叶生物技术有限公司），Rat IGE ELISA试剂盒（上海源叶生物技术有限公司），402AI型超声雾化器（上海鱼跃医疗设备有限公司），酶标阅读仪（雷杜），计算机图像分析系统（ipp6.0）。
1.3动物分组、造模及给药
6-8周龄雄性SD大鼠40只，SPF级，体质量180－220g，购于安徽医科大学实验动物中心，许可证号：SCYKB(皖)2011-002。随机分为正常组、模型组、麻杏石甘汤组、地塞米松组，每组10只。
制备热哮模型，除正常组外，各组均在第1、8天腹腔注射10%卵1ml致敏，同时鼻滴40ulLPS稀释液入大鼠双侧鼻孔（终浓度400ug.ml-1），从第15天开始以1%卵蛋白溶液超声雾化诱喘，每次30min，每日一次，连续7天，以大鼠出现发热、烦躁、汗多、口渴、点头、节律性收腹样喘促等现象，提示模型复制成功。正常组参照上述方法，只是致敏与激发时均以生理盐水代替卵蛋白溶液，不用LPS滴鼻。造模成功后，继续雾化激发4周。造模后第21天开始给药。正常组、模型组灌胃等容积的9.0/L氯化钠溶液，地塞米松组灌服[0.405 g.kg-1.d-1]，麻杏石甘汤组灌服[3.78 g·kg-1·d-1]。末次激发2h内，取左肺固定，右肺直接-80℃冻存备用。
1.4病理检测
左上肺用中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察肺组织的病理变化。
1.5IgE、CP的测定（ELISA）：设标准空；加样；温育；配液；洗涤；加酶；温育；洗涤；显色；终止测定各孔的吸光度（OD值）；结果判定：绘制出标准品线性回归曲线；按直线回归方程式计算出样品浓度，再乘以稀释倍数5，即为样品的实际浓度。
1.6统计学方法：采用SPSS17.0统计软件分析。计量资料用均数±标准差（）表示。多组资料比较采用方差分析，组间比较采用LSD，当P＜0.05为有统计学差异，当P＜0.01为有显著性差异。
2结果
2.1病理形态学改变
正常组大鼠肺组织支气管和肺泡结构清晰，气道纤毛上皮排列整齐，管壁完整，无明显炎症改变及胶原纤维沉积，基底膜较薄；模型组大鼠支气管壁增厚，粘膜上皮杯状细胞增生，支气管及肺血管周围有大量炎症细胞浸润，除嗜酸细胞外，还可见较多中性粒细胞、淋巴细胞在气道粘膜及粘膜下浸润，肺泡间隔不同程度增宽，部分断裂；麻杏石甘汤组大鼠支气管壁稍增厚，管腔内见少许粘液，粘膜下、肺泡间质见少量中性粒、嗜酸性粒细胞及淋巴细胞浸润，结构较完整。地塞米松组大鼠管腔结构较完整，支气管管壁稍增厚，支气管周围炎症细胞浸润较模型组减少，粘膜下层及肺泡间质见少许中性粒细胞、嗜酸细胞及淋巴细胞浸润。
2.2一般体征观察；大鼠出现发热、烦躁、口渴、点头、呛咳、节律性收腹样喘促等一系列热哮模型复制成功症状。
2.3肺组织IgE、CP浓度检测（ELISA法）：
结果见表1，模型组与正常组比较， IgE、CP表达均比正常组高（P〈0.01）；治疗组与模型组比较， IgE、CP含量均降低（P〈0.01）。
表1大鼠肺组织IgE、CP表达溶度（ ,n=7，pg.mL-1）
备注：与正常组比较，﹟P<0.05，＊P<0.01；与模型组比较，□P<0.05，△P<0.01。
3讨论
支气管哮喘是由多种炎性细胞及其介质参与的慢性呼吸疾病，我们一直认为导致哮喘的主要致病细胞是嗜酸性粒细胞（EOS），此类嗜酸性粒细胞哮喘（EA）可以被糖皮质激素所抑制。但是近年来出现了以局部中性粒细胞（PMN）侵润为主的炎症，即非嗜酸性粒细胞哮喘（NEA）[3]。此类患者，临床多有感染，出现发热，苔黄，脉数等热证，多为热哮。结合本实验，我们从以下三方面讨论评价热哮模型：中性粒细胞（PMN）评价 ：冷哮患者大多可以确定明确的过敏源, 嗜酸性粒细胞明显增高，多属外源性哮喘。热哮患者大多有呼吸道感染, 多属内源性、混合性哮喘或喘支炎, 其白细胞和中性粒细胞明显增高。因此局部以中性粒细胞为主兼有嗜酸粒细胞和淋巴细胞浸润的气道炎症是热哮模型成功的标志之一，本实验病理检测中热哮模型组中性粒细胞浸润明显，符合此评价标准。刘宗伟等人发现热哮患者的血清总IgE较正常人高[4]，我们的实验结果与其一致。热哮一般伴有感染，因此热哮的免疫反应比其他类型的哮喘高，更容易刺激免疫细胞的大量生成，热哮的IgE水平较健康人显著升高亦是热哮模型成功的标志之一。肥大细胞 (MC)是人速发型过敏反应的主要效应细胞。酶免疫分析法测定cp、类胰蛋白酶、胃蛋白酶，是MC脱颗粒更具有特异性的标志，以上指标在系统性过敏反应病人血清中含量升高，这些变化可作为MC参与疾病发展的准确的临床指征。有学者研究发现肥大细胞羧肽酶更是过敏症的血液新标志物[5]，模型组的CP水平明显高于其他三组，有统计学差异，表明模型组大鼠存在过敏反应，标志热哮模型造模成功。
通过以上指标的检测，可证明模型组为成功的热哮模型。但是推广这个中医热哮动物模型，还需要进一步应用相应的药物进行反证，因此该模型还有待更加深入的探讨评价。
参考文献
[1] 苏成程,章匀,唐艳芬,黄海凤.哮喘病各证型发病特点与微观指标分析[J].山西中医2012,28(3):14-15.
[2]刘静. Th17 细胞参与调控哮喘小鼠中性粒细胞性气道炎症的分子机制研究[D].2011,广西：广西医科大学.27-29.
[3] 夏维,任振义 .中性粒细胞性哮喘研究进展[J].医学研究杂志.2012 ,41 (1): 173-175.
[4] 刘宗伟.气管哮喘中医辨证分型与血清IL-25、总IgE关系的临床研究[D].2009,,南京：南京中医药大学. 22-23.
[5] 潘琼,丁梅芳,张舒,宁颖,刘宏伟,魏红,岳虹霓.变态反应性疾病儿童血浆肥大细胞羧肽酶和类糜蛋白酶含量的检测[J].中国当代儿科杂志.2011，13(10):814-816.