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摘 要：为明确不同醇化方式的片烟细菌群落结构差异，以3个等级的片烟为材料，采用气调醇化和自然醇化2种方式进行仓储养护，以初始样为对照，利用MiSeq高通量测序对2种醇化方式的片烟细菌群落结构进行分析。结果表明，醇化3年后，2种醇化方式片烟中细菌的多样性水平降低，且气调醇化法低于自然醇化法;据非度量多维尺度分析，2种醇化方式的样品能明显地区分开来;甲基杆菌属、鞘氨醇单胞菌属占比在醇化过程中呈下降之势，在2种醇化方式之间的差异不显著;盐单胞菌属占比呈上升之势，且气调醇化显著高于自然醇化。
关键词：微生物区系;烟草;仓储养护;气调醇化;自然醇化
中图分类号 TS441 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）11-0051-02
片烟的醇化是指在一定条件下，通过烟叶自身的微生物作用、酶的催化和氧化作用，使烟叶中一些不利于吸食品质的化学物质转化为对感官质量有利的物质，达到提高烟叶使用价值的过程。片烟的仓储醇化主要有2种方法：自然醇化法和气调醇化法。自然醇化法操作简便，成本低。但在实践中存在片烟易于发生霉变和虫蛀等现象，以及醇化周期不易调控、质量最佳状态保持时间较短等不足之处。气调醇化法是在密封环境下，通过人工调控氧气的含量，达到防霉、杀虫、延长片烟储存品质时间的目的。对2种醇化方式差异的研究，目前主要集中在外观质量、感官质量和常规化学成分、pH方面[1-4]。陈善义等[5]研究了气调醇化过程中片烟细菌群落结构变化规律，但关于2种醇化方法片烟细菌区系差异的研究尚不多见。为此，本研究利用MiSeq高通量测序技术分析气调醇化和自然醇化的片烟细菌群落结构的差异，旨在为片煙气调养护的优化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料 试验片烟样品产地为贵州（代号GZ）、福建（代号FJ）、河南（代号HN）。片烟于厦门东孚烟叶仓库（仓库环境年平均气温和相对湿度分别为25℃和58%）采用气调醇化和自然醇化2种方式进行仓储养护。片烟入库后立即取样作为初始样（代号为O）。气调醇化的操作按《片烟贮存养护气调贮存法》YC/T 322—2018[6]相关要求进行。自然醇化则将片烟按200Kg/箱的规格进行装箱打包后，于片烟仓库中自然条件下醇化。醇化3年后分别取样（气调醇化代号为A，自然醇化代号为N）。
1.2 试验方法 样品基因组DNA的提取、PCR扩增、MiSeq测序、数据处理与分析参考包可翔等[7]及陈善义等[5]的研究。
2 结果与分析
2.1 细菌物种的多样性 由表1可知，气调醇化3年的样品Chao值小于初始样及自然醇化3年的样品，表明气调醇化3年后的样品细菌物种丰富度最小;样品Shannon指数均值大小排列为初始样>自然醇化（3年）>气调醇化（3年），且三者之间的差异极显著，这说明醇化3年后的片烟细菌物种多样性低于初始水平，且气调醇化法醇化的片烟细菌多样性水平最低。
2.2 属水平细菌群落的结构差异 由图1可知，初始样、气调及自然醇化法醇化后3年的片烟表面的细菌菌群，主要由甲基杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、Aureimonas、假单胞菌属、大肠志贺氏杆菌、葡萄球菌属、盐单胞菌属组成。甲基杆菌属、鞘氨醇单胞菌属占比在醇化3年后的样品中显著低于初始样，而在自然醇化和气调醇化样品之间的差异不显著;盐单胞菌属占比在初始样、自然醇化及气调醇化后3年的样品中差异极显著，其占比排列为气调醇化（3年）>自然醇化（3年）>初始样（表2）。这说明在属分类水平上，相较于初始样而言，醇化3年后片烟的细菌群落结构发生了巨大的变化，表现为：甲基杆菌属、鞘氨醇单胞菌属占比显著下降;而盐单胞菌属占比显著提高，且气调醇化其菌群占比显著高于自然醇化。
2.3 NMDS分析 非度量多维尺度（Nonmetric Multidimensional Scaling，NMDS）分析通过描述样品间的距离远近关系，进一步说明了样品间细菌群落结构的相似性和差异性。由图2可知，同一种处理的样品在NMDS二维图上距离较近（除初始样的HN-O样品之外），不同处理的样品距离较远，这说明片烟细菌群落结构在不同处理间差异大于同一处理内样品之间的差异;此外，自然醇化3年后和气调醇化3年后的样品与初始样的样品距离较大，说明醇化3年后，片烟细菌的群落结构相较于初始样变化较大。
3 讨论
利用MiSeq高通量测序分析了气调醇化及自然醇化3年后的片烟与初始样中细菌的物种多样性和群落结构差异，发现醇化3年后的片烟细菌物种丰富性和多样性水平降低，这与伍雪莹等[8]、杨金奎等[9]对陈化烤烟微生物的变化研究结果一致。周家喜等[10]对烟叶陈化过程细菌群落演替特征的研究中发现，甲基杆菌属的丰度随醇化过程的进行呈下降之势，鞘氨醇单胞菌属则呈上升之势，而本研究发现上述2个菌属占比均低于初始水平。造成这一差异的可能的原因是周家喜等[10]的研究主要关注醇化24个月以内的时期，而本研究关注醇化36个月后的细菌区系。本研究发现，醇化3年后，2种醇化方式片烟细菌群落结构的差异主要表现在盐单胞菌属的占比上。盐单胞菌属属于盐单胞菌科，是一类能在绝对盐度（NaCl）为0～32%条件下生长的耐盐细菌[11]。醇化较久的烟叶，是否在微生物的代谢过程中生成一些盐类物质尚不清楚。盐单胞菌属在烟叶醇化过程中的作用，以及不同醇化方式的片烟有关盐类物质含量的差异有待进一步的研究。
4 结论
片烟在醇化过程中，细菌群落结构发生了显著的变化，甲基杆菌属、鞘氨醇单胞菌属占比下降，盐单胞菌属占比上升;自然醇化和气调醇化片烟细菌的群落结构差异主要表现在盐单胞菌属占比上，且气调醇化高于自然醇化。
参考文献
[1]杨欣玲，杨永锋，张俊岭，等.气调贮存技术对片烟醇化质量的影响[J].河南农业科学，2017，46（10）：153-159.
[2]张明乾，范坚强，包可翔，等.四段式气调贮存与常规贮存条件下烤烟片烟的质量差异分析[J].安徽农学通报，2020，26（02-03）：39-41.
[3]黄立兵，曾经纬，吴让新，等.气氛调控养护对片烟醇化质量的影响[J].安徽农业科学，2017，45（3）：86-89.
[4]何伟，范坚强，牟文君，等.片烟四段式气调绿色醇化技术体系的构建[J].中国烟草学报，2020，26（6）：32-44.
[5]陈善义，李菁菁，林俭，等.基于高通量测序的不同产地和部位自然醇化片烟真菌群落结构分析[J].烟草科技，2018，51（4）：12-19.
[6]国家烟草专卖局.片烟气调贮存养护技术规范：YC/T322—2018[S].北京：中国标准出版社，2019.
[7]包可翔，林俭，何伟，等.不同产地和部位对片烟自然醇化过程中细菌群落结构的影响[J].烟草科技，2017，50（4）：10-17.
[8]伍雪莹，梁书利，韩双艳，等.不同陈化期烤烟叶表细菌的多样性及发育分析[J].广东农业科学，2014，41（18）：28-33，38.
[9]杨金奎，段焰青，陈春梅，等.醇化烟叶表面可培养微生物的鉴定和系统发育分析[J].烟草科技，2008（11）：51-55.
[10]周家喜，喻理飞，张健，等.烟叶陈化过程细菌群落演替特征[J].生态学报，2018，38（21）：7739-7748.
[11]朱凤玲，曲凌云，洪旭光，等.盐单胞茵属一新种的分离与鉴定[J].海洋科学进展，2011，29（2）：221-228.
（责编：王慧晴）
关键词：微生物区系;烟草;仓储养护;气调醇化;自然醇化
中图分类号 TS441 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）11-0051-02
片烟的醇化是指在一定条件下，通过烟叶自身的微生物作用、酶的催化和氧化作用，使烟叶中一些不利于吸食品质的化学物质转化为对感官质量有利的物质，达到提高烟叶使用价值的过程。片烟的仓储醇化主要有2种方法：自然醇化法和气调醇化法。自然醇化法操作简便，成本低。但在实践中存在片烟易于发生霉变和虫蛀等现象，以及醇化周期不易调控、质量最佳状态保持时间较短等不足之处。气调醇化法是在密封环境下，通过人工调控氧气的含量，达到防霉、杀虫、延长片烟储存品质时间的目的。对2种醇化方式差异的研究，目前主要集中在外观质量、感官质量和常规化学成分、pH方面[1-4]。陈善义等[5]研究了气调醇化过程中片烟细菌群落结构变化规律，但关于2种醇化方法片烟细菌区系差异的研究尚不多见。为此，本研究利用MiSeq高通量测序技术分析气调醇化和自然醇化的片烟细菌群落结构的差异，旨在为片煙气调养护的优化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料 试验片烟样品产地为贵州（代号GZ）、福建（代号FJ）、河南（代号HN）。片烟于厦门东孚烟叶仓库（仓库环境年平均气温和相对湿度分别为25℃和58%）采用气调醇化和自然醇化2种方式进行仓储养护。片烟入库后立即取样作为初始样（代号为O）。气调醇化的操作按《片烟贮存养护气调贮存法》YC/T 322—2018[6]相关要求进行。自然醇化则将片烟按200Kg/箱的规格进行装箱打包后，于片烟仓库中自然条件下醇化。醇化3年后分别取样（气调醇化代号为A，自然醇化代号为N）。
1.2 试验方法 样品基因组DNA的提取、PCR扩增、MiSeq测序、数据处理与分析参考包可翔等[7]及陈善义等[5]的研究。
2 结果与分析
2.1 细菌物种的多样性 由表1可知，气调醇化3年的样品Chao值小于初始样及自然醇化3年的样品，表明气调醇化3年后的样品细菌物种丰富度最小;样品Shannon指数均值大小排列为初始样>自然醇化（3年）>气调醇化（3年），且三者之间的差异极显著，这说明醇化3年后的片烟细菌物种多样性低于初始水平，且气调醇化法醇化的片烟细菌多样性水平最低。
2.2 属水平细菌群落的结构差异 由图1可知，初始样、气调及自然醇化法醇化后3年的片烟表面的细菌菌群，主要由甲基杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、Aureimonas、假单胞菌属、大肠志贺氏杆菌、葡萄球菌属、盐单胞菌属组成。甲基杆菌属、鞘氨醇单胞菌属占比在醇化3年后的样品中显著低于初始样，而在自然醇化和气调醇化样品之间的差异不显著;盐单胞菌属占比在初始样、自然醇化及气调醇化后3年的样品中差异极显著，其占比排列为气调醇化（3年）>自然醇化（3年）>初始样（表2）。这说明在属分类水平上，相较于初始样而言，醇化3年后片烟的细菌群落结构发生了巨大的变化，表现为：甲基杆菌属、鞘氨醇单胞菌属占比显著下降;而盐单胞菌属占比显著提高，且气调醇化其菌群占比显著高于自然醇化。
2.3 NMDS分析 非度量多维尺度（Nonmetric Multidimensional Scaling，NMDS）分析通过描述样品间的距离远近关系，进一步说明了样品间细菌群落结构的相似性和差异性。由图2可知，同一种处理的样品在NMDS二维图上距离较近（除初始样的HN-O样品之外），不同处理的样品距离较远，这说明片烟细菌群落结构在不同处理间差异大于同一处理内样品之间的差异;此外，自然醇化3年后和气调醇化3年后的样品与初始样的样品距离较大，说明醇化3年后，片烟细菌的群落结构相较于初始样变化较大。
3 讨论
利用MiSeq高通量测序分析了气调醇化及自然醇化3年后的片烟与初始样中细菌的物种多样性和群落结构差异，发现醇化3年后的片烟细菌物种丰富性和多样性水平降低，这与伍雪莹等[8]、杨金奎等[9]对陈化烤烟微生物的变化研究结果一致。周家喜等[10]对烟叶陈化过程细菌群落演替特征的研究中发现，甲基杆菌属的丰度随醇化过程的进行呈下降之势，鞘氨醇单胞菌属则呈上升之势，而本研究发现上述2个菌属占比均低于初始水平。造成这一差异的可能的原因是周家喜等[10]的研究主要关注醇化24个月以内的时期，而本研究关注醇化36个月后的细菌区系。本研究发现，醇化3年后，2种醇化方式片烟细菌群落结构的差异主要表现在盐单胞菌属的占比上。盐单胞菌属属于盐单胞菌科，是一类能在绝对盐度（NaCl）为0～32%条件下生长的耐盐细菌[11]。醇化较久的烟叶，是否在微生物的代谢过程中生成一些盐类物质尚不清楚。盐单胞菌属在烟叶醇化过程中的作用，以及不同醇化方式的片烟有关盐类物质含量的差异有待进一步的研究。
4 结论
片烟在醇化过程中，细菌群落结构发生了显著的变化，甲基杆菌属、鞘氨醇单胞菌属占比下降，盐单胞菌属占比上升;自然醇化和气调醇化片烟细菌的群落结构差异主要表现在盐单胞菌属占比上，且气调醇化高于自然醇化。
参考文献
[1]杨欣玲，杨永锋，张俊岭，等.气调贮存技术对片烟醇化质量的影响[J].河南农业科学，2017，46（10）：153-159.
[2]张明乾，范坚强，包可翔，等.四段式气调贮存与常规贮存条件下烤烟片烟的质量差异分析[J].安徽农学通报，2020，26（02-03）：39-41.
[3]黄立兵，曾经纬，吴让新，等.气氛调控养护对片烟醇化质量的影响[J].安徽农业科学，2017，45（3）：86-89.
[4]何伟，范坚强，牟文君，等.片烟四段式气调绿色醇化技术体系的构建[J].中国烟草学报，2020，26（6）：32-44.
[5]陈善义，李菁菁，林俭，等.基于高通量测序的不同产地和部位自然醇化片烟真菌群落结构分析[J].烟草科技，2018，51（4）：12-19.
[6]国家烟草专卖局.片烟气调贮存养护技术规范：YC/T322—2018[S].北京：中国标准出版社，2019.
[7]包可翔，林俭，何伟，等.不同产地和部位对片烟自然醇化过程中细菌群落结构的影响[J].烟草科技，2017，50（4）：10-17.
[8]伍雪莹，梁书利，韩双艳，等.不同陈化期烤烟叶表细菌的多样性及发育分析[J].广东农业科学，2014，41（18）：28-33，38.
[9]杨金奎，段焰青，陈春梅，等.醇化烟叶表面可培养微生物的鉴定和系统发育分析[J].烟草科技，2008（11）：51-55.
[10]周家喜，喻理飞，张健，等.烟叶陈化过程细菌群落演替特征[J].生态学报，2018，38（21）：7739-7748.
[11]朱凤玲，曲凌云，洪旭光，等.盐单胞茵属一新种的分离与鉴定[J].海洋科学进展，2011，29（2）：221-228.
（责编：王慧晴）