论文部分内容阅读
农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室 海南儋州 571737）
摘 要 木霉菌具有抑制植物病原真菌生长的能力，因而成为开发土传根部病害生防菌的首选之一。利用对峙培养法，测定8个木霉菌菌株对3个橡胶树红根病病原真菌的体外拮抗作用，并对筛选出来的木霉菌进行相互间的对峙培养分析。结果表明：有6个木霉菌对3个红根病病原菌具有显著拮抗效果；所选出的6个木霉菌之间尽管多数可以共存，但存在空间和营养竞争，尤其是棘孢木霉，很容易被其它木霉菌抑制和侵占，因此，在今后使用时不适宜混配。该实验结果可为进一步筛选和利用生防菌防治橡胶树根部病害提供理论依据。
关键词 木霉菌 ；拮抗作用 ；橡胶树红根病 ；生物防治
分类号 S794.1 ；S476+.1
Abstract Trichoderma spp. has capacities of inhibiting or killing many pathogenic fungi， which make them one of the most promising bio-control agents of many soil-borne pathogens. In this study， the antagonistic effects of eight strains of Trichoderma on the soil-borne Ganoderma pseudoferreum， the pathogen of red root disease in Hevea brasiliensis， were tested with duel culture in vitro， as well as tested the mutual competitive effects among different Trichoderma strains selected. The results showed that six strains demonstrated markedly inhibiting effects and speciality to different pathogen strains. Obvious competition on nutrient and space were observed among the strains of Trichoderma spp.， especially the strong inhibition of the Trichoderma asperellum strain by other ones. Therefore， it is not recommended to mix them for synergistic bio-control function in future applications. These preliminary results will help further screening and utilization of the bio-control agents in the management of soil-borne pathogens of Hevea brasiliensis root diseases.
Keywords Trichoderma spp. ； antagonistic function ； Hevea brasiliensis Ganoderma pseudoferreum ； biocontrol
橡胶树红根病病原菌为Ganoderma pseudoferreum （Wakef.） Over.et steinm[1-2]，具有寄主多[3]、潜伏期长、在土壤中蔓延迅速[4]等特点。红根病病原菌属于真菌界担子菌门，层菌纲，灵芝属，它危害巴西橡胶树根颈部，传播速度很快[4]。红根病菌主要依靠根系接触传染，也可通过风雨和昆虫传播[5]。橡胶树红根病在我国各植胶区内发生普遍，感染严重的林段发病率可达4.0%[4]，若没有及时处理，死亡率可达100%[6]。橡胶树根病的调查需要大量人力劳动，早期跟踪调查工作不到位，普查效率低。而当橡胶树地上部出现明显的病症时，已侵染发病严重，防治成本高且防效差。此病害的防治措施主要是采用化学防治和机械挖除[7-9]。2010年，尼日利亚N. O. Ogbebor等[10]开始筛选生防菌（包括木霉菌）用于防治橡胶树红根病，但至今还未见防治效果的报道，国内也未见利用木霉菌防治橡胶树根病的报道。但是，近20年来，利用木霉菌进行根病防治的工作在多种经济和粮食作物上迅速展开，例如杨树[11]，水稻[12]，中草药[13]，西瓜[14]等。因此，分离筛选具有拮抗橡胶树红根病的生防木霉菌，对橡胶树根病综合防控措施的合理制定具有指导作用，有利于橡胶树种植业的持久、安全发展。
木霉菌（Trichoderma spp.）是一类重要的多功能益生真菌，广泛存在于自然界中，资源丰富，种类众多[15]，不仅能通过多种机制来控制病原菌的侵染和病害的发生，且还具有促进作物生长、提高作物抗生物和非生物胁迫的能力[16-19]，是一种公认的环境友好型真菌[20]。针对土传病害具有潜伏期长、危害大的特点，近年来筛选优良木霉菌用于防治土传病害的工作进展很快[13，15，21]。
本文利用体外对峙实验[22]，选用具有拮抗多种植物病原菌能力的8株多功能木霉菌株[23]，鉴定其是否具有拮抗橡胶树红根病病原菌的效果。研究结果可为创制防治橡胶树根部病害的新型生物农药奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
橡胶树红根病病原菌（G. pseudoferreum）菌株YN1、BT和DF采自不同橡胶种植区[24]，由本研究所种质资源课题组提供；PDA平板保存于4℃冰箱，并定期复苏培养。所用的8个木霉菌分别为ACCC31639、ACCC31642、ACCC31657、ACCC31637、ACCC31757、ACCC30536（棘孢木霉Tri.asperellum）、HCS和DJ1。其中，HCS为商业化的哈茨木霉产品（美国拜沃-哈茨木霉菌根部专用型杀菌剂），棘孢木霉ACCC30536购自中国菌种网站（http：//www.mum800.com/），DJ1来自上海交通大学农业与生物学院，由陈捷教授惠赠；其余5个木霉菌均来自农业部微生物资源收集与保藏重点实验室，由顾金刚教授惠赠，已证明这些菌株具有拮抗多种重要经济作物病原菌的能力，如棉花黄萎病菌（Verticilium dahliae）、番茄灰霉病菌（B. cinerea）等[23]。 1.2 方法
1.2.1 木霉菌、红根病菌的复壮增殖培养
PDA培养基[24]，用于木霉菌和红根病菌的复苏培养以及木霉-病原菌对峙培养。
培养方法：在新鲜配置的PDA培养基上接种0.6 cm木霉菌和病原菌菌块，在30℃恒温培养箱中培养，每天观察和测量菌株的生长直径，并记录和拍照，等木霉菌长满整个培养皿，红根病菌菌体长至6 cm时，4℃低温保存。
橡胶树红根病病菌的增殖培养方法：参照高秀兵等[25]对橡胶树根病病原菌的培养方法，用晒干橡胶树木屑 82%、麦麸15%、葡萄糖 2%、石膏粉 1%（质量百分比）， 加水混匀至湿润，高温灭菌后，放至室温。在培养瓶中无菌接种病菌菌块2～3个，并稍微压实一下，在30℃恒温培养箱中扩增培养。
1.2.2 对峙培养与抑菌率
在相同的PDA培养基上，与木霉菌生长速度相比，红根病病菌（G. Pseudoferreum）在PDA培养基上生长较慢（日平均生长速度为0.5～1 cm），并且菌丝生长稀薄，很容易呈现老化形态。为了更准确鉴定木霉菌的拮抗效果，采用直径0.6 cm的打孔器在新鲜配置的PDA培养基上打个孔，用灭菌后的小勺子把复壮培养好的红根病菌填入到小孔中，在30℃恒温培养箱中培养，等病菌直径长至约4 cm时，再打另外一个孔接种木霉菌，二者间隔2～3 cm，每个菌株重复接种3次。在30℃恒温培养箱中培养并定期观察、记录和拍照。定期测量红根病病菌的生长直径，同时测量没接种木霉菌的红根病病菌的生长情况（对照），计算抑制率。
抑菌率（%）=（对照组红根病病菌的菌落半径-处理组红根病病菌的菌落半径）×100/对照组红根病病菌的菌落半径。数据处理利用统计分析软件DPS 7.5进行。
2 结果与分析
2.1 红根病病菌的生长情况
选用橡胶木屑复壮培养病菌接种，红根病病菌在PDA平板上菌丝体生长致密，呈现亮白色，具旺盛生长活力。表明利用橡胶木屑复壮培养的红根病病菌生长良好，可以应用于后续的生防菌拮抗对峙实验。见图1。
2.2 8个木霉菌株的形态特征
根据木霉菌株在PDA培养基上的生长与产孢特性，HCS、DJ1、ACCC31757和ACCC31657属于产孢型菌株，而其余4株属于产丝型菌株，其不同的生长特征见表1和图2。
2.3 对峙分析
对峙培养实验结果表明，除了ACCC31637 和DJ1外，其余6个木霉菌都对3株红根病菌均有显著的拮抗效果，能够在15 d内抑制、侵占、甚至杀死红根病病菌菌丝体。这6个木霉菌对3种橡胶树红根病菌的拮抗能力大小有一定差异，且整体上产丝型木霉菌比产孢型木霉菌抑制病菌生长的能力更强（图3，表2）。
从与DF对峙培养拮抗效果看，6个木霉菌的拮抗能力高低顺序为：HCS>ACCC31657>ACCC30536>ACCC31639>ACCC31642>ACCC31757；从与BT对峙培养拮抗效果看，其拮抗能力顺序为HCS>ACCC31757>ACCC31639>ACCC31642>ACCC31657>ACCC30536；与YN1的拮抗能力顺序为HCS>ACCC31757>ACCC30536>ACCC31657>ACCC31642>ACCC31639。
从8个木霉菌与橡胶树红根病菌的对峙动态分析中得知，经过10 d的对峙培养，对3种红根病菌的抑制率最低的是ACCC31637和DJ1，其余6个木霉菌对红根病菌YN1的抑制率差异较大，为39%～100%，对BT和DF的抑制率差异小，分别为58.84%～100%和60%～100%。其中HCS、ACCC31757、ACCC31639、ACCC31642和ACCC31657 这5个木霉菌对红根病BT株系的抑制率能达到100%；HCS和ACCC31757两个木霉菌对红根病YN1株系的抑制为100%；HCS和ACCC31657两个木霉菌对红根病DF株系的抑制率达100%。
2.4 木霉菌混配共生能力分析
木霉菌顽强的竞争生存能力是其拮抗能力的重要组成部分，在前期实验的基础上，选择对3种红根病菌拮抗能力强的ACCC31639、ACCC31757、HCS和ACCC30536这四个木霉菌，分析其是否存在共生或抑制作用。在同一个平板上同时接种4个不同组合的木霉菌株（ACCC31639、ACCC31757、HCS和ACCC30536），培养4 d后，观察和拍照。结果发现，棘孢木霉菌株ACCC30536的生存空间被其它3个木霉菌株侵占。其中，ACCC31639的竞争能力很强，共培养4 d可以逐渐侵占HCS的生长空间。尽管这些木霉菌之间一定程度上可共存，但相互间主要产生抑制，因此混合施用不同木霉菌来协同拮抗红根病菌的做法效果可能不佳。见图4。
3 讨论与结论
本实验结果表明，所选用的8个木霉菌中，有6个木霉菌对3株橡胶树红根病病菌表现出很强的体外拮抗能力，但不同木霉菌之间存在拮抗作用，所以，在今后的生产应用中，不同木霉菌株不宜混配，应主要考虑木霉菌与肥料、杀菌剂等其他成分的混配。据报道，海南橡胶树红根病病菌的性状差异达到变种级水平，被分为类型Ⅰ和类型Ⅱ两个不同变种[26]。但本实验结果表明6个木霉菌对3个红根病病原菌的拮抗能力差异不大，间接表明所检测的3个病原菌有可能属于同一个变种类型，因此，本文结果不能反映测试木霉菌菌株对橡胶树红根病病菌的综合拮抗能力。在后续工作中，需要采集来源更广泛的橡胶树红根病病菌菌株进行测定，以期科学评估木霉菌菌株的体外拮抗能力与应用前景。
体外对峙实验尽管是生防菌筛选的重要手段，但往往仅是筛选工作的第一步，生防菌田间施用后会受到土壤环境（特别是土著微生物）、根际定植、天气和人为干预等众多因素的影响。今后还需要在深入了解其生物学特征的基础上，采用多种筛选方法继续评估木霉菌的实际应用效果[27]。例如检测木霉菌在橡胶苗根际的定植能力、促生效果和大田应用中对其他主要橡胶树根病病原菌的拮抗实效等。同时，还需加强筛选在橡胶树根际定殖的本地木霉菌株或其内生木霉菌株，它们可能会具有更好的区域适应性，深入了解木霉菌对橡胶根病病菌的拮抗机制，进行木霉菌的诱导突变、菌株筛选与改良等。 致 谢 对上海交通大学农业与生物学院陈捷教授技术指导，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所的顾金刚博士为本实验提供实验菌株，并提出宝贵建议，在此一并致谢！
参考文献
[1] 张运强，张辉强，邓晓东. 橡胶树红根病病原菌的鉴定[J]. 热带作物学报，1997（1）：16-23.
[2] 张运强，谢艺贤，张辉强. 橡胶树红根病病原菌的鉴定（Ⅱ）[J]. 热带作物学报，2000，21（1）：20-24.
[3] 何 康，黄宗道. 热带北缘橡胶树栽培[M]. 广州市：广东科技出版社，1987：498.
[4] 张运强，张辉强. 橡胶树红根病的蔓延速度及预测预报[J]. 热带作物学报，1998（1）：7-12.
[5] 约 翰，陈楚苹. 橡胶树根病的孢子传播[J]. 世界热带农业信息，1965（3）：13-15.
[6] 白建相，王 涓，黄 林，等. 云南河口垦区橡胶树根病普查及治理方法探讨[J]. 热带农业科技，2008（4）：7-11.
[7] 詹兴球，蔡江文. 75%十三吗啉乳油防治橡胶红根病田间药效试验[J]. 热带农业科学， 2012（5）： 59-60.
[8] 李四有，邱学俊. 丙环唑防治橡胶树红根病田间试验[J]. 热带生物学报，2012（4）：325-328.
[9] 谭象生，范会雄. 橡胶树红根病在橡胶园的演变及防治对策[J]. 植物保护，1991（6）：46-48.
[10] O. Ogbebor N， T. Adekunle A， O. Eghafona N， et al. Ganoderma psuedoferreum： Biological control possibilities with microorganisms isolated from soils of rubber plantations in Nigeria[J]. African Journal of General Agriculture， 2010， 6（4）： 301-305.
[11] 项存悌，高克祥，何秉章，等. 杨树烂皮病生物防治的研究[J]. 东北林业大学学报，1991（6）：15-25.
[12] 梁志怀，魏 林，陈玉荣，等. 哈茨木霉在水稻体内的定殖及其对水稻纹枯病抗性的影响[J]. 中国生物防治，2009（2）：143-147.
[13] 李琼芳，曾华兰，叶鹏盛，等. 哈茨木霉（Trichoerma harzianum）T23生防菌筛选及防治中药材根腐病的研究[J]. 西南大学学报（自然科学版），2007（11）：119-122.
[14] 张称英，汪祖国，卫 勤，等. 交大木霉菌改良菌株“交大农威”防治西瓜枯萎病示范试验简报[J]. 上海
农业科技，2012（5）：116-122.
[15] Schuster André， Schmoll Monika. Biology and biotechnology of Trichoderma[J]. Appl Microbiol Biot， 2010， 87（3）： 787-799.
[16] 陈 捷，朱洁伟，张 婷，等. 木霉菌生物防治作用机理与应用研究进展[J]. 中国生物防治学报，2011（2）：145-151.
[17] Harman G E. Overview of Mechanisms and Uses of Trichoderma spp[J]. Phytopathology， 2006， 96（2）： 190-194.
[18] Shoresh M， Harman G E， Mastouri F. Induced systemic resistance and plant responses to fungal biocontrol agents[J]. Annu Rev Phytopathol， 2010， 48： 21-43.
[19] Harman G E. Multifunctional fungal plant symbionts： new tools to enhance plant growth and productivity[J]. New Phytol， 2011， 189（3）： 647-649.
[20] Tripathi P， Singh P C， Mishra A， et al. Trichoderma： a potential bioremediator for environmental clean up[J]. Clean Technologies and Environmental Policy， 2013， 15： 541-550.
[21] 孙兴全，王秉丽，陈 捷，等. 木霉菌肥喷施桃树效果初探[J]. 中国果树，2012（1）：75.
[22] 张 瑾，张树武，徐秉良，等. 长枝木霉菌抑菌谱测定及其抑菌作用机理研究[J]. 中国生态农业学报，2014，22（6）：661-667.
[23] 丁德娟，李世贵，唐顺明，等. 木霉菌属ITS PCR-RFLP及抗病多样性差异分析[J]. 生物技术通报，2012（8）：146-153.
[24] 涂 敏，蔡海滨，孙爱花，等. 巴西橡胶树红根病菌DNA提取有效方法比较[J]. 中国农学通报，2012（34）：12-16.
[25] 高秀兵，李增平，李晓娜，等. 橡胶树几种根病的人工接种方法[J]. 热带作物学报，2010（4）：626-630.
[26] 张运强，谢艺贤，张辉强. 橡胶树红根病病原菌的鉴定（Ⅱ）[J]. 热带作物学报，2000（1）：20-24.
[27] 熊 敏，高必达，陈 捷. 拮抗尖孢镰刀菌的木霉菌筛选方法评估[J]. 中国生物防治学报，2011（4）：498-503.
摘 要 木霉菌具有抑制植物病原真菌生长的能力，因而成为开发土传根部病害生防菌的首选之一。利用对峙培养法，测定8个木霉菌菌株对3个橡胶树红根病病原真菌的体外拮抗作用，并对筛选出来的木霉菌进行相互间的对峙培养分析。结果表明：有6个木霉菌对3个红根病病原菌具有显著拮抗效果；所选出的6个木霉菌之间尽管多数可以共存，但存在空间和营养竞争，尤其是棘孢木霉，很容易被其它木霉菌抑制和侵占，因此，在今后使用时不适宜混配。该实验结果可为进一步筛选和利用生防菌防治橡胶树根部病害提供理论依据。
关键词 木霉菌 ；拮抗作用 ；橡胶树红根病 ；生物防治
分类号 S794.1 ；S476+.1
Abstract Trichoderma spp. has capacities of inhibiting or killing many pathogenic fungi， which make them one of the most promising bio-control agents of many soil-borne pathogens. In this study， the antagonistic effects of eight strains of Trichoderma on the soil-borne Ganoderma pseudoferreum， the pathogen of red root disease in Hevea brasiliensis， were tested with duel culture in vitro， as well as tested the mutual competitive effects among different Trichoderma strains selected. The results showed that six strains demonstrated markedly inhibiting effects and speciality to different pathogen strains. Obvious competition on nutrient and space were observed among the strains of Trichoderma spp.， especially the strong inhibition of the Trichoderma asperellum strain by other ones. Therefore， it is not recommended to mix them for synergistic bio-control function in future applications. These preliminary results will help further screening and utilization of the bio-control agents in the management of soil-borne pathogens of Hevea brasiliensis root diseases.
Keywords Trichoderma spp. ； antagonistic function ； Hevea brasiliensis Ganoderma pseudoferreum ； biocontrol
橡胶树红根病病原菌为Ganoderma pseudoferreum （Wakef.） Over.et steinm[1-2]，具有寄主多[3]、潜伏期长、在土壤中蔓延迅速[4]等特点。红根病病原菌属于真菌界担子菌门，层菌纲，灵芝属，它危害巴西橡胶树根颈部，传播速度很快[4]。红根病菌主要依靠根系接触传染，也可通过风雨和昆虫传播[5]。橡胶树红根病在我国各植胶区内发生普遍，感染严重的林段发病率可达4.0%[4]，若没有及时处理，死亡率可达100%[6]。橡胶树根病的调查需要大量人力劳动，早期跟踪调查工作不到位，普查效率低。而当橡胶树地上部出现明显的病症时，已侵染发病严重，防治成本高且防效差。此病害的防治措施主要是采用化学防治和机械挖除[7-9]。2010年，尼日利亚N. O. Ogbebor等[10]开始筛选生防菌（包括木霉菌）用于防治橡胶树红根病，但至今还未见防治效果的报道，国内也未见利用木霉菌防治橡胶树根病的报道。但是，近20年来，利用木霉菌进行根病防治的工作在多种经济和粮食作物上迅速展开，例如杨树[11]，水稻[12]，中草药[13]，西瓜[14]等。因此，分离筛选具有拮抗橡胶树红根病的生防木霉菌，对橡胶树根病综合防控措施的合理制定具有指导作用，有利于橡胶树种植业的持久、安全发展。
木霉菌（Trichoderma spp.）是一类重要的多功能益生真菌，广泛存在于自然界中，资源丰富，种类众多[15]，不仅能通过多种机制来控制病原菌的侵染和病害的发生，且还具有促进作物生长、提高作物抗生物和非生物胁迫的能力[16-19]，是一种公认的环境友好型真菌[20]。针对土传病害具有潜伏期长、危害大的特点，近年来筛选优良木霉菌用于防治土传病害的工作进展很快[13，15，21]。
本文利用体外对峙实验[22]，选用具有拮抗多种植物病原菌能力的8株多功能木霉菌株[23]，鉴定其是否具有拮抗橡胶树红根病病原菌的效果。研究结果可为创制防治橡胶树根部病害的新型生物农药奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
橡胶树红根病病原菌（G. pseudoferreum）菌株YN1、BT和DF采自不同橡胶种植区[24]，由本研究所种质资源课题组提供；PDA平板保存于4℃冰箱，并定期复苏培养。所用的8个木霉菌分别为ACCC31639、ACCC31642、ACCC31657、ACCC31637、ACCC31757、ACCC30536（棘孢木霉Tri.asperellum）、HCS和DJ1。其中，HCS为商业化的哈茨木霉产品（美国拜沃-哈茨木霉菌根部专用型杀菌剂），棘孢木霉ACCC30536购自中国菌种网站（http：//www.mum800.com/），DJ1来自上海交通大学农业与生物学院，由陈捷教授惠赠；其余5个木霉菌均来自农业部微生物资源收集与保藏重点实验室，由顾金刚教授惠赠，已证明这些菌株具有拮抗多种重要经济作物病原菌的能力，如棉花黄萎病菌（Verticilium dahliae）、番茄灰霉病菌（B. cinerea）等[23]。 1.2 方法
1.2.1 木霉菌、红根病菌的复壮增殖培养
PDA培养基[24]，用于木霉菌和红根病菌的复苏培养以及木霉-病原菌对峙培养。
培养方法：在新鲜配置的PDA培养基上接种0.6 cm木霉菌和病原菌菌块，在30℃恒温培养箱中培养，每天观察和测量菌株的生长直径，并记录和拍照，等木霉菌长满整个培养皿，红根病菌菌体长至6 cm时，4℃低温保存。
橡胶树红根病病菌的增殖培养方法：参照高秀兵等[25]对橡胶树根病病原菌的培养方法，用晒干橡胶树木屑 82%、麦麸15%、葡萄糖 2%、石膏粉 1%（质量百分比）， 加水混匀至湿润，高温灭菌后，放至室温。在培养瓶中无菌接种病菌菌块2～3个，并稍微压实一下，在30℃恒温培养箱中扩增培养。
1.2.2 对峙培养与抑菌率
在相同的PDA培养基上，与木霉菌生长速度相比，红根病病菌（G. Pseudoferreum）在PDA培养基上生长较慢（日平均生长速度为0.5～1 cm），并且菌丝生长稀薄，很容易呈现老化形态。为了更准确鉴定木霉菌的拮抗效果，采用直径0.6 cm的打孔器在新鲜配置的PDA培养基上打个孔，用灭菌后的小勺子把复壮培养好的红根病菌填入到小孔中，在30℃恒温培养箱中培养，等病菌直径长至约4 cm时，再打另外一个孔接种木霉菌，二者间隔2～3 cm，每个菌株重复接种3次。在30℃恒温培养箱中培养并定期观察、记录和拍照。定期测量红根病病菌的生长直径，同时测量没接种木霉菌的红根病病菌的生长情况（对照），计算抑制率。
抑菌率（%）=（对照组红根病病菌的菌落半径-处理组红根病病菌的菌落半径）×100/对照组红根病病菌的菌落半径。数据处理利用统计分析软件DPS 7.5进行。
2 结果与分析
2.1 红根病病菌的生长情况
选用橡胶木屑复壮培养病菌接种，红根病病菌在PDA平板上菌丝体生长致密，呈现亮白色，具旺盛生长活力。表明利用橡胶木屑复壮培养的红根病病菌生长良好，可以应用于后续的生防菌拮抗对峙实验。见图1。
2.2 8个木霉菌株的形态特征
根据木霉菌株在PDA培养基上的生长与产孢特性，HCS、DJ1、ACCC31757和ACCC31657属于产孢型菌株，而其余4株属于产丝型菌株，其不同的生长特征见表1和图2。
2.3 对峙分析
对峙培养实验结果表明，除了ACCC31637 和DJ1外，其余6个木霉菌都对3株红根病菌均有显著的拮抗效果，能够在15 d内抑制、侵占、甚至杀死红根病病菌菌丝体。这6个木霉菌对3种橡胶树红根病菌的拮抗能力大小有一定差异，且整体上产丝型木霉菌比产孢型木霉菌抑制病菌生长的能力更强（图3，表2）。
从与DF对峙培养拮抗效果看，6个木霉菌的拮抗能力高低顺序为：HCS>ACCC31657>ACCC30536>ACCC31639>ACCC31642>ACCC31757；从与BT对峙培养拮抗效果看，其拮抗能力顺序为HCS>ACCC31757>ACCC31639>ACCC31642>ACCC31657>ACCC30536；与YN1的拮抗能力顺序为HCS>ACCC31757>ACCC30536>ACCC31657>ACCC31642>ACCC31639。
从8个木霉菌与橡胶树红根病菌的对峙动态分析中得知，经过10 d的对峙培养，对3种红根病菌的抑制率最低的是ACCC31637和DJ1，其余6个木霉菌对红根病菌YN1的抑制率差异较大，为39%～100%，对BT和DF的抑制率差异小，分别为58.84%～100%和60%～100%。其中HCS、ACCC31757、ACCC31639、ACCC31642和ACCC31657 这5个木霉菌对红根病BT株系的抑制率能达到100%；HCS和ACCC31757两个木霉菌对红根病YN1株系的抑制为100%；HCS和ACCC31657两个木霉菌对红根病DF株系的抑制率达100%。
2.4 木霉菌混配共生能力分析
木霉菌顽强的竞争生存能力是其拮抗能力的重要组成部分，在前期实验的基础上，选择对3种红根病菌拮抗能力强的ACCC31639、ACCC31757、HCS和ACCC30536这四个木霉菌，分析其是否存在共生或抑制作用。在同一个平板上同时接种4个不同组合的木霉菌株（ACCC31639、ACCC31757、HCS和ACCC30536），培养4 d后，观察和拍照。结果发现，棘孢木霉菌株ACCC30536的生存空间被其它3个木霉菌株侵占。其中，ACCC31639的竞争能力很强，共培养4 d可以逐渐侵占HCS的生长空间。尽管这些木霉菌之间一定程度上可共存，但相互间主要产生抑制，因此混合施用不同木霉菌来协同拮抗红根病菌的做法效果可能不佳。见图4。
3 讨论与结论
本实验结果表明，所选用的8个木霉菌中，有6个木霉菌对3株橡胶树红根病病菌表现出很强的体外拮抗能力，但不同木霉菌之间存在拮抗作用，所以，在今后的生产应用中，不同木霉菌株不宜混配，应主要考虑木霉菌与肥料、杀菌剂等其他成分的混配。据报道，海南橡胶树红根病病菌的性状差异达到变种级水平，被分为类型Ⅰ和类型Ⅱ两个不同变种[26]。但本实验结果表明6个木霉菌对3个红根病病原菌的拮抗能力差异不大，间接表明所检测的3个病原菌有可能属于同一个变种类型，因此，本文结果不能反映测试木霉菌菌株对橡胶树红根病病菌的综合拮抗能力。在后续工作中，需要采集来源更广泛的橡胶树红根病病菌菌株进行测定，以期科学评估木霉菌菌株的体外拮抗能力与应用前景。
体外对峙实验尽管是生防菌筛选的重要手段，但往往仅是筛选工作的第一步，生防菌田间施用后会受到土壤环境（特别是土著微生物）、根际定植、天气和人为干预等众多因素的影响。今后还需要在深入了解其生物学特征的基础上，采用多种筛选方法继续评估木霉菌的实际应用效果[27]。例如检测木霉菌在橡胶苗根际的定植能力、促生效果和大田应用中对其他主要橡胶树根病病原菌的拮抗实效等。同时，还需加强筛选在橡胶树根际定殖的本地木霉菌株或其内生木霉菌株，它们可能会具有更好的区域适应性，深入了解木霉菌对橡胶根病病菌的拮抗机制，进行木霉菌的诱导突变、菌株筛选与改良等。 致 谢 对上海交通大学农业与生物学院陈捷教授技术指导，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所的顾金刚博士为本实验提供实验菌株，并提出宝贵建议，在此一并致谢！
参考文献
[1] 张运强，张辉强，邓晓东. 橡胶树红根病病原菌的鉴定[J]. 热带作物学报，1997（1）：16-23.
[2] 张运强，谢艺贤，张辉强. 橡胶树红根病病原菌的鉴定（Ⅱ）[J]. 热带作物学报，2000，21（1）：20-24.
[3] 何 康，黄宗道. 热带北缘橡胶树栽培[M]. 广州市：广东科技出版社，1987：498.
[4] 张运强，张辉强. 橡胶树红根病的蔓延速度及预测预报[J]. 热带作物学报，1998（1）：7-12.
[5] 约 翰，陈楚苹. 橡胶树根病的孢子传播[J]. 世界热带农业信息，1965（3）：13-15.
[6] 白建相，王 涓，黄 林，等. 云南河口垦区橡胶树根病普查及治理方法探讨[J]. 热带农业科技，2008（4）：7-11.
[7] 詹兴球，蔡江文. 75%十三吗啉乳油防治橡胶红根病田间药效试验[J]. 热带农业科学， 2012（5）： 59-60.
[8] 李四有，邱学俊. 丙环唑防治橡胶树红根病田间试验[J]. 热带生物学报，2012（4）：325-328.
[9] 谭象生，范会雄. 橡胶树红根病在橡胶园的演变及防治对策[J]. 植物保护，1991（6）：46-48.
[10] O. Ogbebor N， T. Adekunle A， O. Eghafona N， et al. Ganoderma psuedoferreum： Biological control possibilities with microorganisms isolated from soils of rubber plantations in Nigeria[J]. African Journal of General Agriculture， 2010， 6（4）： 301-305.
[11] 项存悌，高克祥，何秉章，等. 杨树烂皮病生物防治的研究[J]. 东北林业大学学报，1991（6）：15-25.
[12] 梁志怀，魏 林，陈玉荣，等. 哈茨木霉在水稻体内的定殖及其对水稻纹枯病抗性的影响[J]. 中国生物防治，2009（2）：143-147.
[13] 李琼芳，曾华兰，叶鹏盛，等. 哈茨木霉（Trichoerma harzianum）T23生防菌筛选及防治中药材根腐病的研究[J]. 西南大学学报（自然科学版），2007（11）：119-122.
[14] 张称英，汪祖国，卫 勤，等. 交大木霉菌改良菌株“交大农威”防治西瓜枯萎病示范试验简报[J]. 上海
农业科技，2012（5）：116-122.
[15] Schuster André， Schmoll Monika. Biology and biotechnology of Trichoderma[J]. Appl Microbiol Biot， 2010， 87（3）： 787-799.
[16] 陈 捷，朱洁伟，张 婷，等. 木霉菌生物防治作用机理与应用研究进展[J]. 中国生物防治学报，2011（2）：145-151.
[17] Harman G E. Overview of Mechanisms and Uses of Trichoderma spp[J]. Phytopathology， 2006， 96（2）： 190-194.
[18] Shoresh M， Harman G E， Mastouri F. Induced systemic resistance and plant responses to fungal biocontrol agents[J]. Annu Rev Phytopathol， 2010， 48： 21-43.
[19] Harman G E. Multifunctional fungal plant symbionts： new tools to enhance plant growth and productivity[J]. New Phytol， 2011， 189（3）： 647-649.
[20] Tripathi P， Singh P C， Mishra A， et al. Trichoderma： a potential bioremediator for environmental clean up[J]. Clean Technologies and Environmental Policy， 2013， 15： 541-550.
[21] 孙兴全，王秉丽，陈 捷，等. 木霉菌肥喷施桃树效果初探[J]. 中国果树，2012（1）：75.
[22] 张 瑾，张树武，徐秉良，等. 长枝木霉菌抑菌谱测定及其抑菌作用机理研究[J]. 中国生态农业学报，2014，22（6）：661-667.
[23] 丁德娟，李世贵，唐顺明，等. 木霉菌属ITS PCR-RFLP及抗病多样性差异分析[J]. 生物技术通报，2012（8）：146-153.
[24] 涂 敏，蔡海滨，孙爱花，等. 巴西橡胶树红根病菌DNA提取有效方法比较[J]. 中国农学通报，2012（34）：12-16.
[25] 高秀兵，李增平，李晓娜，等. 橡胶树几种根病的人工接种方法[J]. 热带作物学报，2010（4）：626-630.
[26] 张运强，谢艺贤，张辉强. 橡胶树红根病病原菌的鉴定（Ⅱ）[J]. 热带作物学报，2000（1）：20-24.
[27] 熊 敏，高必达，陈 捷. 拮抗尖孢镰刀菌的木霉菌筛选方法评估[J]. 中国生物防治学报，2011（4）：498-503.